【摘要】 目的：观察全反式视黄酸（alltrans retinoic acid, RA）对体外培养的人巩膜成纤维细胞（human scleral fibroblasts, HSF）的形态、增殖能力和自我更新能力以及细胞周期的影响，探讨RA对巩膜成纤维细胞的作用。方法：原代培养HSF，波形蛋白和角蛋白对细胞进行鉴定。用不同浓度RA培养HSF，相差显微镜下动态观察其形态和数量变化；MTT法检测HSF在不同浓度RA培养后的细胞增殖和自我更新能力；FCM方法检测不同浓度RA对HSF细胞周期的影响。 结果：MTT法显示RA对HSF有明显的抑制作用,该效应呈剂量依赖性反应。RA培养后HSF细胞数目减少，细胞收缩,突起减少，部分裂解，胞浆内有空泡和颗粒形成，细胞之间的间隙增宽，细胞变得细长，呈束状或不规则排列。FCM结果显示和对照组比较，随着RA浓度和时间的增加，G0/G1期细胞的比例逐渐上升，而S期和G2期细胞比例相应下降，细胞被阻滞在G0/G1期。结论：RA可抑制体外培养HSF的增殖和DNA合成。
【关键词】 视黄酸 巩膜 成纤维细胞
0引言
巩膜是一层由胶原纤维鞘和成纤维细胞构成的结缔组织，在眼球生长和重塑过程中起了重要的作用。巩膜组织结构的维持大部分依赖其主要成分—成纤维细胞的活性。近视眼患者的巩膜变薄，胶原纤维变细，成纤维细胞减少。近年来研究表明RA对鸡巩膜成纤维细胞的增生有抑制作用[1]，可中度抑制其收缩[2]，但RA抑制细胞增殖，刺激分化的机制并不完全清楚。RA是维生素A的一种代谢产物,在脊椎动物的眼球发育中具有重要作用。RA在维持视觉、成人视网膜结构[35]及眼球形态[6，7]中是必不可少的，RA调节基因的表达[8]，是眼球发育的关键分子[9]。研究表明实验性近视发生时视网膜、脉络膜和巩膜的RA代谢过程均有改变,所以RA很可能是调节实验性近视眼球伸长的信息分子,通过与细胞核中视黄酸受体结合调控基因表达,从而发挥抑制细胞增生、诱导细胞分化的作用[911]。本研究选用人的巩膜成纤维进行体外原代培养,直接观察RA对HSF的形态、数目、增殖能力和细胞周期的影响,探讨RA在近视眼巩膜重塑中的作用。
1材料和方法
1.1组织取材及细胞培养 取我中心眼库角膜移植后供体眼球（无眼部疾病）两只，均于死后24h内取材。先将取得的眼球用含有400U/mL庆大霉素的生理盐水浸泡
图1 原代培养HSF细胞鉴定（400×） A：波形蛋白在HSF胞浆内强烈表达；B：角蛋白在HSF内表达阴性
30min，在无菌操作台内先将巩膜外的视神经、球结膜等组织剪除干净，然后沿角膜缘剪开眼球，翻转眼球，将眼球内容物全部清除，无菌纱布将残余的脉络膜等刮除干净，去除眼前段、玻璃体、视网膜、脉络膜及巩膜外软组织。PBS冲洗3次，将后极部巩膜剪成1mm×1mm×1mm大小的组织块，摆放于25cm2培养瓶中。贴壁2h后加入80U/mL庆大霉素和100mL/L胎牛血清的DMEM培养液，置37℃，50mL/L CO2培养箱内，每隔2～3d换液，待细胞融合后，用2.5g/L胰蛋白酶，0.2g/L EDTA(1∶1)进行消化以1∶2～4传代，取第4～6代的细胞进行实验。
1.2免疫细胞化学染色鉴定 制备细胞爬片，检测波形蛋白和角蛋白的表达：含1.3mL/L过氧化氢的盐酸甲醇室温封闭内源性过氧化物酶15min；20g/L BSA室温孵育30min；分别加兔抗小鼠波形蛋白多克隆抗体和兔抗小鼠角蛋白多克隆抗体，加PBS作阴性对照，4℃过夜；加生物素标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30min；加辣根过氧化物标记的卵白素，37℃孵育30min；DAB显色；封片。
1.3 MTT试验 用2.5g/L胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液配成单个细胞悬液，以每孔103个细胞接种到96孔板，每孔体积200μL。将96孔板放入CO2培养箱，在37℃、50mL/L CO2及饱和湿度条件下，培养24h。按照试验分组RA药物浓度0.001，0.01，0.1，1，10，100，1000μmol/L更换培养液，除阳性对照组外，其余各组均使用不含血清的培养液，避免血清干扰。将96孔板放入CO2培养箱，在37℃、50mL/L CO2及饱和湿度条件下，培养24，48，72h后，每孔加入MTT溶液（5g/L)20μL，37℃继续孵育4h，倒置显微镜下观察细胞到发现细胞内出现紫色点状沉淀，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL DMSO，振荡10min使结晶物充分溶解。选择570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，重复实验3次取平均值，以药物浓度为横轴，细胞存活率为纵轴绘制曲线。
1.4细胞形态观察 将细胞以3×105传代到25cm2培养瓶，置培养箱中培养24h，分别加入RA浓度为5，10μmol/L的DMEM/F12，对照组加入单纯的DMEM/F12培养24，48，72h在显微镜下观察细胞形态并拍照。
1.5 FCM FCM（flurocytometry）细胞以3×105/瓶的密度接种于25cm2培养瓶，用不含FBS的DMEM/F12培养液同步化12h随机将细胞分为实验组和对照组。实验组分别换上含5，10μmol/L RA的DMEM/F12，对照组则单纯为DMEM/F12。加药后放入培养箱内孵育24h和48h,吸除表1 不同浓度RA对HSF细胞数目的影响
旧液，洗涤3次，2.5g/L胰蛋白酶消化3min，再用含50mL/L胎牛血清的DMEM/F12中止消化并吹打成单细胞悬液，1000r/min离心10min，收集细胞，用冷PBS洗涤1次并1000r/min离心10min，700mL/L乙醇固定，4℃保存,待FCM测定，各时间点，各个RA浓度的细胞取3瓶进行实验，重复3次取平均值。各组待测细胞取1×106 (0.1mL)，用PBS洗两遍，去上清后加入300μL DNA染液（内含碘化丙啶PI 100mg/L和RNA酶20U/mL），室温染色30min，即可上机检测。用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期加以分析。
统计学处理：实验数据以±s表示，组间均数比较利用t检验，率的比较利用χ2检验，P≤0.05被认为具有显著性差异。统计学分析用SPSS10.0软件包。
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