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2结果
2.1免疫细胞化学鉴定 波形蛋白染色阳性，胞浆内可见棕黄色阳性反应产物；角蛋白染色阴性，证实所培养的细胞为人巩膜成纤维细胞(图1)。
2.2形态学观察 光镜下对照组的人巩膜成纤维细胞生长旺盛,呈梭形,大小均一,排列规则紧密,呈涡旋状或者放射状排列，胞体光滑；实验组随着所用的RA浓度的升高、时间的延长，细胞形态学改变愈明显,表现为细胞数目减少，细胞收缩,突起减少，部分裂解，胞浆内有空泡和颗粒形成，细胞之间的间隙增宽，细胞变得细长，呈束状或不规则排列。在高浓度时，细胞大部分裂解，看不到完整的细胞存在，只有裂解的碎片。用5,10μmol/L RA培养HSF细胞24,48,72h后，在相差显微镜下观察细胞形态变化(图2)。
2.3细胞数目的变化 图2中B1,B2,B3在400倍光学显微镜下观察，计数一个视野内所见细胞数，随着所用RA浓度的增高，细胞数目逐渐减少。但在同一用药浓度下，随着时间的延长细胞数目逐渐增多，在用药48h后才逐渐减少,结果(表1)。
2.4 MTT结果 HSF在用不同浓度RA作用24，48，72h后的MTT检测结果显示：随着药物浓度增高，A值降低，细胞存活率下降，呈现出剂量依赖关系。和对照组相比，图2 不同浓度RA培养HSF细胞的形态学改变（200×） A1，A2，A3对照；B1，B2，B3：5μmol/L RA;C1,C2,C3:10μmol/L RA;A1,B1,C1：24h；A2，B2，C2：48h；A3，B3，C3：72h
在用药24h,RA浓度为0.1μmol/L时，其细胞存活率即有显著性差异；但72h后，0.001μmol/L的RA即对HSF有显著性作用。具体结果（图3）。
2.5 FCM结果 经RA刺激HSF 24，48h后，和对照组比较，HSF细胞周期发生明显的改变，随着RA浓度的增加，G0/G1期细胞的比例逐渐上升，而S期和G2期细胞比例相应下降，细胞被阻滞在G0/G1期。RA对GSF增生的抑制作用表现在细胞生长的各个时期,在各个时间点，加入不同浓度的RA对HSF都有抑制作用。提示一定浓度的RA可使HSF的生长减慢,增生受到抑制，但随着时间的增加，在5μmol/L的RA作用48h后，G1期细胞有所降低，S期细胞升高，说明RA并不是完全抑制HSF生长的，具体结果（表2）。
3讨论
我们通过原代培养HSF，用一定浓度的RA培养HSF后，细胞数目减少，细胞收缩,突起减少，部分裂解，胞浆内有空泡和颗粒形成，细胞之间的间隙增宽，细胞变得细长，呈束状或不规则排列；随着RA浓度的增高，细胞很快裂解。MTT是公认的评价细胞活性的指标。我们的MTT试验结果显示随着所用RA浓度的增高、时间的延长，细胞存活率下降，呈现出剂量依赖关系，这和Yan等[12]的结果相一致；FCM检测细胞周期显示在用5，10μmol/L的RA培养HSF后，细胞周期中G0/G1期细胞的比例逐渐上升，而S期和G2期细胞比例相应下降，细胞被阻滞在G0/G1期。但随着时间的增加，在5μmol/L的RA作用48h后，G1期细胞比用药24h时降低，S期细胞升高，这和用药表2 不同浓度RA对HSF细胞周期的影响48h后我们观察到的细胞数目的改变相对应，提示一定浓度的RA可使HSF的生长减慢,增生受到抑制，但不是完全抑制了HSF生长。细胞增殖周期中，在G1期和S期之间及G2期和M期之间，存在影响细胞周期进行的控制点，一旦细胞通过这些控制点，将不能阻止细胞进入和通过S期或M期[13]，RA对细胞增殖的影响可能正是通过上述环节来实现的。Mertz等[1419]采用体外与在体相结合的研究方法对脉络膜RA和RA对巩膜的影响做了研究，发现将生理浓度的RA加入培养的巩膜中会引起巩膜蛋白多糖的合成下降，而蛋白多糖是巩膜细胞外基质的主要成分，在巩膜的胶原纤维形成和组织排列中发挥了重要作用。所以在实验性近视眼中，RA很可能是通过抑制巩膜成纤维细胞的增殖，改变其细胞外基质的组成和胶原纤维的排列，促使巩膜变薄，进而使之发生一系列的病理改变。RA可以抑制体外培养HSF的增殖和DNA合成，其浓度变化最终引起HSF形态和功能的改变。
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