作者：张军　崔巍　高伟　牧荣   

　　作者单位：1（010059）中国内蒙古自治区呼和浩特市，内蒙古医学院研究生院02级研究生；2（010017）中国内蒙古自治区呼和浩特市，内蒙古自治区医院眼科；3（010017）中国内蒙古自治区呼和浩特市，内蒙古自治区医院病理科

　　【摘要】目的：观察-4℃纯甘油保存方法对羊膜活性的影响。

　　方法：取健康剖宫产产妇胎盘，剥离羊膜，分成2cm×2cm小块，保存于-4℃纯甘油中，3，7，14，30，60，90d后，分别进行光镜，酶组织化学[乳酸脱氢酶（LDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）]及免疫组织化学[碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）]观察，并于新鲜羊膜对比。

　　结果：光镜下，-4℃纯甘油保存60d以内羊膜上皮层结构较完整，可见少数细胞破裂。胞核脱失。90d组上皮层结构破坏明显，多数细胞破裂，核脱失。酶组织化学（LDH、SDH）及免疫组织化学（bFGF）显示：60d内各组于新鲜羊膜比较无显著差异性；各组间两两比较亦无显著性差异（P > 0.05）。而90d组于新鲜对照组及各实验组间两两比较均有显著性差异（P <0.05）。

　　结论：羊膜在-4℃纯甘油保存60d内；组织结构；上皮细胞活性稳定。

　　【关键词】  羊膜　活性　保存

　　Effect of preservation in glycerol at -4℃ on amniotic membrane vitality

　　Jun Zhang1, Wei Cui2, Wei Gao2, Rong Mu3

　　1Postgraduate School of Inner Mongolia Medical College, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China； 2Department of Ophthalmology, 3Department of Pathological, Inner Mongolia Hospital, Hohhot 010017; Inner Mongolia Autonomous Region, China

　　Abstract AIM: To investigate the vitality of amniotic membrane preserved in glycerol at -4℃METHODS: Fresh amniotic membrane (AM) attached to healthy placentas was taken and preserved in glycerol at -4℃. After 3, 7,14, 30, 60, 90d, the epithelial structure (light microscope) and the enzyme activity (SDH and LDH) of AM was analyzed by immunohistochemical method combining with image analysis system to investigate the changes of the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) in AM. RESULTS: Most of the epithelial cells of AM preserved in glycerol at -4℃ remained intact after 60d. The vitality of AM had a stable level.CONCLUSION: The vitality of AM preserved at -4℃ glycerol decreased with time. After 60-d preservation, the vitality of AM decreased significantly. Therefore operators can select high-level AM to treat ocular surface diseases.

　　· KEYWORDS: amniotic membrane; vitality; preservation

　　0引言

　　1995年Tseng[1] 利用保存羊膜移植重建眼表获得成功。羊膜移植治疗眼表疾病已成为国内外眼科学者关注的热点。然而目前的研究多集中于羊膜移植的临床效果和作用机制。有关羊膜保存方法及其对羊膜活性影响的报道甚少。我们应用光镜，酶组织化学及免疫组织化学方法，探讨-4℃纯甘油保存方法对羊膜活性的影响，明确羊膜的有效保存时间。

　　1材料和方法

　　1.1材料 取HBsAg、衣原体、人免疫缺陷病毒及梅毒均为阴性的健康孕妇剖宫产所获得的胎盘，在无菌条件下将胎盘用无菌生理盐水冲洗干净。置于含青霉素50mg/L、链霉素50mg/L、新霉素100mg/L、二性霉素B 2.5mg/L的生理盐水中浸泡10min，钝性剥离羊膜，使其与绒毛膜分离。将羊膜平铺于粘贴手术巾的纸片上，羊膜的粗糙面与纸的粗糙面相贴，羊膜上皮面朝上[2,3]。然后将附有羊膜的纸片剪成2.5cm×2.5cm方形小块，放入无菌纯甘油3mL的小瓶中，并置于-4℃冰箱中保存。bFGF兔抗人抗体，北京中山生物制品有限公司提供。S-P试剂盒，北京中山生物工程有限公司提供。纯甘油（上海运佳黄浦制药有限公司提供，分析纯级）。

　　1.2方法 40g/L中性甲醛固定，石蜡包埋后连续切片8张（4张免疫组化应用），厚约4μm，HE染色后光镜观察。将羊膜制成厚约8μm的冰冻切片，每个样本切8张，每种酶4张（其中一张为阴性对照），行乳酸脱氢酶（LDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）组织化学染色。应用图象分析系统（VIDS-21软件），随机测定8个高倍镜视野中羊膜上皮层光密度平均值。 免疫组织化学染色（ABC法）：石蜡切片脱蜡至水，自来水冲洗2～3min；双蒸水2次×2min。滴加bFGF一抗兔IgG，稀释度1∶200，37℃水浴箱内孵育1.5h，0.01mol/L PBS洗2min×3次，PBS代替一抗染色作为阴性对照。滴加生物素化山羊抗兔IgG（稀释度1∶300），37℃水浴箱内20min，0.01mol/L PBS洗2min×3次。DAB显色，镜下控制反应时间。脱水，透明，封片。图象分析系统（VIDS-21软件）随机测量8个高倍镜视野羊膜上皮层的光密度值。阴性对照以PBS代替一抗。

　　统计学处理：使用SPSS 11.0统计处理软件，采用重复测量资料的方差分析，将各组结果平均值行单因素方差分析P <0.05表示有显著性差异。

　　2结果

　　2.1光镜观察 羊膜分3层，自内向外为单层立方上皮细胞、厚而连续的基底膜和疏松的海绵状层，含成纤维细胞，无血管分布，其中胶原纤维丰富且连续，弹性纤维少。纯甘油-4℃保存羊膜3，7，14，30，60d羊膜上皮细胞层和基底膜较完整，少数上皮细胞可见核固缩，及空泡变性，但正常形态上皮细胞依然丰富。90d显示绝大数上皮细胞内空泡增多，明显的核固缩及核溶解，上皮细胞破裂丢失，甚至基底膜变薄，出现断裂。

　　2.2酶组织化学测定 LDH分布于细胞质中，呈蓝色颗粒，SDH分布于细胞质中，呈紫红色颗粒。保存3，7，14，30， 60d，与新鲜对照组及各实验组间比较均无显著性差异 （P >0.05）；而90d组与新鲜对照组及其他各实验组间比较均有显著性差异（P <0.05，表1）。

　　2.3免疫组织化学染色 bFGF分布于羊膜上皮层和基质层，染色以连续的棕黄色为阳性分布，阴性对照未见染色。3～60d实验组与新鲜对照组及各组间比较均无显著性差异（P >0.05）；而90d组与新鲜对照组及其他各组间比较均有显著性差异（P <0.05）。

　　图1 保存60d羊膜上皮层LDH酶组织化学染色×400

　　图2 保存60d羊膜上皮层SDH酶组织化学染色×400

　　3讨论

　　近年来，随着羊膜移植在治疗眼表疾病中的显著疗效，羊膜日益成为眼表重建中的重要生物学材料[4,5]。然而，新鲜羊膜难以满足临床需求，所以羊膜的保存方法及其对羊膜活性影响研究也越发重要。我们探讨了-4℃纯甘油保存方法对羊膜活性的影响；明确-4℃纯甘油有效保存期提供指导；为术者选择优质羊膜，提高羊膜移植疗效提供客观依据。有的学者[6]认为-4℃纯甘油保存的羊膜无细胞活性，仅为基底膜。用保存羊膜移植仅是无细胞活性的基底膜移植。但本实验研究提示：-4℃纯甘油保存法60d内的羊膜，其组织结构和上皮细胞内LDH，SDH，bFGF等活性物质的表达维持在一相对稳定的水平，与新鲜羊膜对照组及各实验组之间比较均未见显著差异性（P >0.05）。而90d保存组与新鲜对照组及其他实验组之间比较均有显著差异性（P <0.05）。这表明-4℃纯甘油保存的羊膜并非无细胞活性的基底膜，而是具有活性上皮细胞的全层组织。

　　我们的研究提示：-4℃纯甘油保存羊膜60d内的上皮层结构，即使有部分上皮细胞核固缩存在，但未影响上皮细胞内LDH，SDH，bFGF等活性物质的表达。其中SDH（为有氧代谢的重要酶），LDH（为无氧酵解的关键酶）。他们的表达强弱对羊膜上皮层细胞活性的表达至关重要。而bFGF分布于羊膜上皮层和基质层。研究表明bFGF在细胞，器官培养中均能有效地促进角膜上皮再生，改善角膜愈合质量[7-9]。实验发现，bFGF能促进角角膜后基质的修复，降低炎症反应程度，改善修复质量，维持角膜透明并促进损伤区角膜基质纤维的板层化排列趋势，从而加快了角膜创口的修复。实验显示bFGF在伤口早期8d左右，即能明显促进伤口愈合强度[10]。羊膜移植后随着羊膜上皮细胞的溶解，活性物质亦随之释放。我们认为-4℃纯甘油保存羊膜的活性在60d内的维持在一相对稳定水平，使用60d内的保存羊膜，其临床治疗效果可能更加令人满意。

　　【参考文献】

　　1 Tseng SCG. Transplantation of preserved human amniotic membrane for surface reconstruction in severely damaged rabbit cornea. Cornea ,1995;14:437-440

　　2 Prabhasawat P, Tseng SCG. Impression cytology study of epithelial phenotype of ocular surface reconstructed by preserved human amniotic membrane. Arch Ophthalmol ,1997;115:1360-1363

　　3 Lee SH, Tseng SCG. Amniotic membrane transplantation for persistent epithelial. Am J Ophthalmol ,1997;123(3):303-312

　　4吴勇,黄振平,姜涛,王少华.保存羊膜移植在眼重建方面的临床应用.国际眼科杂志,2005;5(6):1214-1216

　　5游向东,金中秋,吴建国,李志伟,李丽莎.羊膜移植治疗眼部化学烧伤的前瞻性研究.国际眼科杂志,2005;5(2):288-290

　　6李学东,孙秉基,徐锦堂.羊膜移植治疗重度角结膜碱烧伤后新生血管性角膜白斑.眼科研究,1998;16(2):115-118

　　7 David T, Rieck P, Renard G. Corneal wound healing moudulation using basic fibroblast growth factor after laser photorefractive keratectory. Cornea ,1995;14(3):227-234

　　8侯光辉,江振友. EGF、BFGF、TGF-β对培养鸡角膜缘上皮细胞增殖性影响.中国实用眼科杂志,2002;20(11):868-871

　　9李永平,林健贤,唐祝华.碱性成纤维细胞生长因子促进角膜碱烧伤上皮修复的实验研究.眼外伤与职业眼病杂志,1998;20(5):403-454

　　10戴超,刘翔.EGF、BFGF对兔自体穿透性角膜移植伤口愈合的影响.第二军医大学学报,2001;23(2):211-214