【摘要】  建立体外内层血视网膜屏障（iBRB）模型并研究视网膜Müller胶质细胞（RMGC）对紧密连接（TJ）的影响。

    方法：采用免疫磁珠方法原代纯化和培养大鼠视网膜微血管内皮细胞（RMEC），采用改良酶消化方法培养RMGC，RMEC和RMGC在微孔膜的两侧共培养建立iBRB模型，通过相差显微镜和透射电子显微镜（TEM）观察两种细胞的生长和TJ的形态。采用跨内皮细胞电阻（TER）测量和TJ相关蛋白ZO-1荧光染色和蛋白电泳来评价TJ的变化情况。
    结果：RMEC和RMGC均可在膜上正常生长，RMGC间紧密连接。TEM观察高TER值样品中相邻RMEC形成典型的TJ结构。RMEC层TER在8d时达到最高，为(86.3±7.9) Ω·cm2，此后保持相对稳定。在RMGC存在的共培养组TER 7d时为 (97.6±3.6) Ω·cm2，约为7d时RMEC组的2倍，8 d达到峰值(113.5±5.3) Ω·cm2。在iBRB模型发展过程中，ZO-1的表达强度随时间延长而增加。

    结论：通过RMEC和RMGC的共培养可以建立体外iBRB模型，RMGC加快RMEC间的TJ成熟。

    【关键词】  视网膜

     0引言

     视网膜为了有效地发挥其功能，需要一个稳定的内环境，这一内环境稳定性的维持依赖于内层血视网膜屏障。内层血视网膜屏障是由视网膜微血管内皮细胞（RMEC）、RMEC间紧密连接（TJ）、基底膜、周细胞、胶质细胞足突和极狭小的细胞外间隙共同组成的一个复合体，是存在于视网膜神经层的血管与神经组织之间的一个动态的调节界面[1-3]。在动物体内许多实验已经得出血视网膜内屏障中，视网膜Müller胶质细胞（RMGC）与RMEC之间存在多种形态和功能学上的联系，但这些因素受到动物个体差异、种群差异及其它神经组织的影响，于是就需要建立一种简化的内层血视网膜屏障（iBRB）的体外模型。我们采用原代培养的RMGC与RMEC建立体外iBRB模型，并研究RMGC对于屏障TJ的作用。

    1材料和方法

    1.1材料  ①RMEC培养及鉴定：选择Wistar大鼠15只，乙醚麻醉处死，取出眼球，置于含有青霉素/链霉素的PBS中浸泡5min取出，无菌操作取出视网膜，用PBS冲洗，剪碎，1g/LⅠ型胶原酶（Sigma）消化30min，过双层的53μm尼龙筛网（上海德华金属网带有限公司），收集滤液离心，洗涤细胞，加入PECAM抗体包被的免疫磁珠，4℃孵育30min，置于磁珠分离装置（MCP-1, Dynal）上用100mL/L FBS洗涤结合磁珠的细胞，将细胞接种于明胶包被的培养板中，加入含75g/L内皮生长添加剂（Sigma）的100mL/L 胎牛血清（FBS，杭州四季青）的培养液。细胞培养箱（Heraeus）环境为37℃，50mL/L CO2，950mL/L 空气，细胞扩增传代采用2.5g/L胰酶（Gibco）和0.2g/L EDTA（1∶1）混合消化液（TE）。RMEC鉴定采用兔抗大鼠Ⅷ因子抗体（Zymed）免疫组化染色。②RMGC的培养及鉴定：出生2d的Wistar新生鼠麻醉处死，取出眼球，剥离视网膜，用PBS冲洗，剪碎，用2.5g/L胰酶消化20min，加入100mL/L FBS终止消化，经53μm尼龙筛网，细胞悬液离心洗涤后接种于培养板中，加入100mL /L FBS培养液。培养环境及传代方法同RMEC。RMGC鉴定采用兔抗大鼠GFAP（Dako）和小鼠抗大鼠vimentin（Dako）免疫组化染色。③体内iBRB模型建立方法 采用改良Tretiach 等[4]和Nakashima 等[5]方法，预先使用10g/L明胶包被的聚酯材料、微孔孔径0.4μm、微孔膜面积4.67mm2 的Transwell（No. 3450，Corning）小室。第5～6代REMC生长接近70%时，弃去血清培养液，加入无血清培养液，继续培养24h。取第3～4代生长状态良好的Müller细胞，换液加入RMEC培养基，继续培养24h以上。TE消化两种细胞制成单细胞悬液，共培养组先将Transwell小室倒置，RMGC按照10 000/cm2的密度接种于小室外底面，在37℃孵箱中待其大部分贴壁（约2h），翻转置于多孔板孔中，RMEC按照20 000/cm2的密度接种于Transwell小室内底面，补充上下室培养液。

    1.2方法  Transwell（Corning）小室共48只，分为共培养组20只，RMEC组20只，Müller细胞组4只和空白组4只。RMEC组和Müller细胞组Transwell小室分别只接种RMEC和Müller细胞。空白组不接种细胞。跨细胞层电阻测量是评估内皮细胞细胞旁通道通透性的重要方法之一[6]。在共培养3～9d时，使用ERS电阻仪(Millipore)测量TER。为避免血清蛋白在电极上沉着，在TER测量时将小室放入37℃ PBS环境中，测量后放回原多孔板，重新加入培养液。操作方法同仪器说明。每个小室测量2次，计算平均值，细胞TER计算方法为各小室TER平均值减去空白组TER平均值，乘以小室滤膜面积。

    1.2.1透射电镜检测  将BRB共培养模型中RMEC贴附的滤膜材料从小室中剪下，在室温下用PBS液清洗，再置于25mL/L戊二醛固定液中，室温下固定1h，冰上固定30min，此时用固定缓冲液清洗3次，每次5min，然后在冰上置于20mL/L锇酸溶液中1h，用固定缓冲液清洗3次，每次5min。然后将滤膜剪成1mm×5mm小条，依次在冰上经过100，300和500mL/L乙醇溶液，每次脱水10min，含20g/L乙酸双氧铀700mL/L乙醇溶液脱水20min，900mL/L和 1 000mL/L乙醇溶液中脱水，每次10min。用乙醇和CO2临界点干燥。透射电镜标本组织包埋在Epon树脂中，制作超薄切片，乙酸双氧铀和枸橼酸铅染色，Hitachi H-600 透射电子显微镜(Japan)观察并照相。扫描电镜标本固定在一个自制平台上，溅射镀金膜， Electronic JSM-840扫描电子显微镜(Japan)观察并照相。

    1.2.2 ZO-1免疫荧光染色  从小室中剪下RMEC贴附的滤膜材料，在室温下用PBS液清洗，在冰上0.2g/L Triton X-100透化孵育2min，PBS液清洗。室温下37g/L 多聚甲醛固定细胞15min，0.5mL/L Triton X-100中孵育5min，用PBS液清洗，封闭血清孵育20min。将滤膜剪成4mm×4mm的小块，RMEC面朝上置于培养皿中，加入ZO-1抗体 (Santa Cruz, 1∶100)在4℃湿房中孵育过夜。空白对照为用PBS代替ZO-1抗体，阴性对照为用免疫前的兔血清代替ZO-1抗体。PBS液清洗，加入羊源性Cy-3-标记IgG(Dako, 1∶200)孵育1h，PBS液清洗3次。置于载玻片上，加500mL/L甘油1滴，封片。部分标本用4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）复染核1min。标本用Olympus BX51倒置荧光显微镜观察，选择不同波长，用532nm波长的绿色激光激发Cy3，在640nm下接收，此时Cy3 发出红色荧光，复染标本，不动标本，切换UV荧光，观察DAPI染色，Retiga 1300 CCD数码相机照相。

    1.2.3 ZO-1蛋白电泳  Transwell小室分为2组，RMEC组和共培养组，每组至少18只。在3，5，7和9d，每组取4只小室进行蛋白检测，0.25g/L胰蛋白酶消化RMEC细胞，同时用吸管吹打，使之脱离培养膜，收集细胞悬液，离心（500g）10min。加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，反复吹打裂解细胞，再离心（15 000 g）60min，弃上清。采用Lowry法，以牛血清白蛋白为标准品，采用Bio-Rad 蛋白电泳仪检测蛋白浓度（DC Protein Assay Kit; BioRad）。按照每泳道10μg加载于SDS-PAGE 凝胶样品孔中，以恒压110V/30mA电泳至溴酚兰抵达凝胶底边。电转印于NC膜上。丽春红染色，TBST缓冲液配制的50g/L脱脂奶粉封闭2h。室温下，加入兔抗鼠ZO-1一抗(1∶500)或兔抗鼠actin一抗(Santa Cruz, 1∶500)，4℃过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次10min。加入HRP标记的二抗(1∶3 000，Dako)，37℃孵育1h，洗膜3次，每次10min。采用ECL化学发光法显色（Pierce）。使用Kodak digital science 1D（Kodak, USA）做蛋白条带光密度分析，半定量结果＝ZO-1蛋白条带光密度/actin蛋白条带光密度。

     统计学处理：实验结果采用均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 10软件统计数据，进行t检验和方差分析，P＜0.05表示数值差异具有统计学意义。

    2结果

    2.1共培养系统中RMEC和RMGC的形态  RMGC接种在微孔滤膜上可于1h贴壁，至3h细胞贴壁牢固，6h开始增生，细胞多角形有较长的突起（图1A）。RMEC接种在微孔滤膜上3h开始贴壁，约6h贴壁牢固，24h开始增生，细胞成多角形或者梭形，3d细胞铺满90%，4d基本融合，单位面积内细胞继续增多，7d单位面积内细胞数量停止增加（图1B）。

    2.2微孔滤膜上细胞的超微结构  透射电镜图像显示RMEC在膜上呈单层生长，细胞内线粒体和内质网丰富，并有该细胞特异的Weibel-Palade小体，RMGC呈复层生长，细胞内有丰富的线粒体、糖原和微丝，细胞间隙较大，两种细胞均可有突起深入微孔中，但在样本中没有发现RMGC和RMEC间的连接。培养9d的模型切片中发现，相邻的RMEC胞膜紧密相连，没有缝隙（图1C）。

    图1A: 多角形微孔膜上的RMGC（bar: 100μm）;B:融合的RMEC;C:紧密连接结构

    2.3跨细胞电阻变化  跨细胞电阻（TER）可以间接的反映RMEC层的紧密连接的变化和屏障功能。图2显示在RMEC单层、RMGC层和共培养层的TER的变化情况。RMEC层TER在8d时达到最高，为（86.3±7.9）Ω·cm2。在有RMGC存在的共培养组TER 7d时为（97.6±3.6）Ω·cm2，约为7d时RMEC组的2倍，8d达到峰值（113.5±5.3）Ω·cm2。RMGC组TER值很低，波动在-5.7～15 Ω·cm2。在6～9d共培养组和RMEC单层的TER差异有统计学意义（P＜0.05）。RMEC单层和共培养层TER峰值约为 86Ω·cm2 和113Ω·cm2，此时细胞间紧密连接发育成熟，可用于进一步的通透性实验。

    图2 RMEC单层、RMGC层和共培养层TER的变化

    2.4细胞间的ZO-1表达变化  在RMEC生长至融合过程中，1d ZO-1在细胞质内表达，3d ZO-1在胞核内强荧光表达，胞质和细胞边缘弱荧光表达，7d细胞边缘荧光增强，胞核和胞质中荧光强度明显减弱。在与RMGC共培养时，RMEC ZO-1表达要强于同时的RMEC单层（图3）。蛋白半定量显示整个培养过程中ZO-1表达随培养时间延长逐渐增强（图4）。

    A,C,E: RMEC单独培养1,3,7d；B,D,F: RMEC共培养1,3,7d

    图3  RMEC与RMGC共培养组和RMEC单独培养组ZO-1在细胞中表达部位变化。各时间点两组RMEC均有ZO-1的表达，在1d ZO-1主要表达在细胞质中，3d ZO-1表达在细胞质、细胞核以及细胞膜上，细胞核内染色较强，细胞膜上表达较弱，7d ZO-1主要表达在细胞间隙和胞膜上，细胞核及细胞质中表达极弱

    图4  共培养组和RMEC组中RMEC ZO-1蛋白表达变化 aP<0.05 vs  RMEC; vs 3, 5d

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