作者：王启常，唐罗生
【摘要】 目的：探讨外源性VEGF诱导的大鼠视网膜血管病变的特点。
方法：大鼠120只随机分为正常对照组、 rrVEGF164低、高浓度组。不同时间行荧光素眼底血管造影、视网膜电图振荡电位、组织学检查。
结果：高浓度组注射rrVEGF164眼从注射后10d表现为眼底后极部视网膜动脉局限性高荧光，2wk时表现为单个视网膜内核层毛细血管管腔窄小，内皮细胞肥大,管腔面积和细胞面积分别与自身对照眼、4，6wk比较，差异有显著性（P ＜0.05）。视网膜电图OPs总波幅2，6wk降低，分别与自身对照眼、4wk比较，差异有显著性（P ＜0.05）。
结论：高浓度高频率注射rrVEGF164 诱导的大鼠视网膜血管病变主要表现有视网膜水肿，大血管扩张，内核层毛细血管管腔变窄、接近闭塞，内皮细胞肥大、增生，周边部玻璃体视网膜纤维血管样膜。
【关键词】 视网膜毛细血管
0引言
VEGF是最重要的促血管形成因子，组织缺血、缺氧是VEGF的启动因素。缺血性眼病的视网膜、视网膜下新生血管膜等均有VEGF的表达，眼内VEGF浓度明显升高[1]。目前有关VEGF的研究大多是离体拮抗外源性VEGF或在体拮抗内源性VEGF的药物抑制实验，而单独应用外源性VEGF进行动物实验，探讨VEGF诱导的视网膜血管病变的特点，国内外研究甚少。我们探讨外源性VEGF诱导的视网膜血管病变的特点，为进一步研究药物拮抗VEGF打下基础。
1材料和方法
1.1材料 Sprague-Daweley大鼠（中南大学湘雅二医院动物实验中心提供，雌雄各半，体质量200～240g）120只随机分为3组：正常对照组36只，不作眼内注射。VEGF低浓度组36只，实验眼（右眼）每次注射浓度为10mg/L 的rrVEGF164 4μL，自身对照眼（左眼）注射等量的0.1mol/L PBS。两眼均为隔天1次，共2次。VEGF高浓度组48只，实验眼每次注射浓度为100mg/L的 rrVEGF164 4μL，自身对照眼注射等量的0.1mol/L PBS。两眼均为隔天1次，共4次。分别于2，4，6wk时均作眼底检查后各随机选取6只作眼底荧光血管造影、6只作视网膜电图振荡电位检查，再各随机抽取6只处死作组织学切片、6只处死作透射电子显微镜观察。VEGF高浓度组剩余12只于12wk时处死，随机选取各6只行组织学切片、透射电子显微镜检查。 Topcon眼底照相机，视觉电生理诊断仪，正方测试格，玻璃毛细管，重组大鼠血管内皮生长因子（rrVEGF164，Sigma公司）， FITC-Dextran（Sigma公司）。
1.2方法 大鼠充分散瞳后，30g/L戊巴比妥钠溶液（1mL/kg）ip麻醉。结膜囊表面麻醉，眼科手术显微镜下用30#B-D针头于背侧角膜缘后1mm处刺穿眼球壁后立即出针，角膜缘行前房穿刺，消毒剪刀将自制玻璃体腔微量注射针针尖剪去，暴露开口。10μL加样移液器抽取rrVEGF164 或PBS 4μL注于消毒的点样纸上。自制玻璃体腔微量注射针立即吸取。沿预先穿刺好的针孔处以45～50°的角度进入眼内并缓慢注射，停留约15s后拔针。术眼涂眼膏，术后3d用3g/L诺氟沙星滴眼液滴眼，2次/d。注射rrVEGF164或PBS前、后，出现玻璃体出血者不纳入实验对象。散瞳后，ip麻醉大鼠，结膜囊表面麻醉。暗适应30min，暗红光下安放3个电极，小号银针柄端连接于电极线末端后，角膜电极插于上方周边部角膜基质层，参考电极置于两眼连线的中点皮下，地电极置于同侧耳根皮下，黑色胶纸遮盖未检查眼。根据国际临床视觉电生理学会制定的视觉电生理标准化方案（1994年），设定刺激参数,双眼分别记录视网膜电图振荡电位(electroretinographic oscillatory potentials, ERG-OPs)。散瞳后眼底荧光血管造影，鼠尾静脉注射50g/L FITC-Dextran 1.0mL，固定动物，注射造影剂后5s，各个方位眼底照相，每次拍片间隔5～10s，持续3min，选择性拍片直至注射造影剂50min。剥离视网膜，常规电镜制片，每只大鼠每眼随机观察2个铜网，每个铜网随机照相2张。同一组、同一眼别的样本分散，使各组样本容量达24张。对视网膜内核层单个毛细血管管腔面积、血管内皮细胞面积进行形态计量，采用正方测试格计数法测量视网膜内核层单个毛细血管管腔面积、血管内皮细胞的面积。
统计学处理：所有数据均用均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS for Windows 11.5统计软件处理。资料正态检验，方差齐性检验后，单因素方差分析，两因素方差分析，P＜0.05为统计学差异有显著性。
2结果
2.1直接眼底镜观察 注射rrVEGF164眼低浓度组在注射后1d表现为玻璃体腔轻度混浊，随后逐渐减轻，至3d恢复透明。高浓度组在注射后1d表现玻璃体中度混浊，5～6d后玻璃体腔恢复透明。约10d表现为眼底后极部大血管轻度结节样扩张，周围视网膜轻度水肿，2wk时重度扩张，4wk时有所加重（图1A）。6wk时与4wk时相比无明显变化。 12wk时玻璃体腔出现纤维组织增生，眼底模糊不清。注射PBS眼无玻璃体混浊，低浓度组和注射PBS眼未出现结节样扩张和视网膜水肿。
2.2眼底荧光血管造影 高浓度组注射rrVEGF164眼视网膜中央动脉约11s开始充盈，灌注时间较正常组延长。注射rrVEGF164后10d表现为眼底后极部视网膜动脉局限性高荧光，荧光素从中央区开始消退。2wk时呈结节样扩张，随时间延长而明显，6wk时与4wk时比较无明显加重。未见视网膜前新生血管渗漏征象（图1B）。3mo时玻璃体腔纤维血管样组织增生，眼底观察困难，未行造影检查。
2.3组织学观察 光镜下低浓度组可见视网膜水肿，各个层次厚度无明显变化。未见突破视网膜内界膜的血管内皮细胞。高浓度组10d时轻度视网膜水肿，2wk时视网膜水肿加重，6wk时视网膜内界膜不完整，视网膜前纤维组织样增生，12wk时在眼底周边部玻璃体视网膜纤维血管样组织增生（图2A，B）。透射电镜显示正常大鼠视网膜内核层毛细血管内皮细胞呈扁长形，细胞核较大，突入毛细血管管腔内。胞质稀少，含有高尔基体、线粒体、粗面内质网等超微结构。高浓度组实验眼2wk时表现为视网膜内核层单个毛细血管内皮细胞肥大、管腔面积变窄（图3A），4wk与6wk时血管管腔、细胞面积恢复正常， 但是6wk时血管内皮细胞增生明显（图3B）。12wk血管内皮细胞增生，毛细血管接近闭塞（图3C）。内核层单个视网膜毛细血管管腔面积和单个视网膜毛细血管内皮细胞面积经配伍设计两因素方差分析，注射rrVEGF164眼同一浓度不同时间各组间比较：100mg/L组差异有显著性，单个视网膜毛细血管管腔面积F＝6964.168，P＝0.000。进一步用多个样本均数q检验，4wk与6wk组差异无显著性，P＝0.449，2wk组与4wk组，2wk组与6wk组差异有显著性。单个视网膜毛细血管内皮细胞面积 F＝108.655，P＝0.000。进一步用多个样本均数q检验，4wk组与6wk组比较差异无显著性，P＝0.935，2wk组与4wk组，2wk组与6wk组差异有显著性(表1)。
2.4视网膜电图振荡电位总波幅（SAOPs） 经配伍设计两因素方差分析，同一浓度不同时间各组间比较：100mg/L组差异有显著性，F＝313.324，P＝0.000。进一步用多个样本均数q检验，2wk组与6wk组比较，差异无显著性，P＝0.559。2wk组与4wk组，6wk组与4wk组差异有显著性（表2）。
[1] [2] 下一页 |
