3讨论

    玻璃体腔注射的量过低，玻璃体腔药物浓度、药物在玻璃体内的弥散受影响。Dureau等[2]研究发现注射量为3μL或者5μL具有丢失量少、可重复性等优点。而Hayashi等[3]的经验是：对200～250g的白化病大鼠注射玻璃体的液体量的原则是最大量不超过玻璃体容积的10%。综合考虑，本实验选择大鼠玻璃体腔内注射rrVEGF164的体积为4μL，前房穿刺可防止注射后眼压升高。高分子量右旋糖苷（2×106）标记的荧光素不会从血管内漏出，背景荧光很低[4]。为了比较清晰的显示视网膜血管病变，不遗漏可能出现的早期新生血管，我们选择50g/L FITC-dextran 1mL鼠尾静脉注射眼底血管造影，大鼠视网膜血管系统显示清晰。正常大鼠眼底荧光血管造影与人眼比较，具有灌注时间短、荧光素完全消退时间延长等特点。我们推测可能与大鼠体表面积少、高分子量的右旋糖苷标记物使荧光素衰减慢有关。

    研究糖尿病视网膜病变时最常用的指标是振荡电位各子波波幅的总和（OPsum）[5]。实验中我们诱导的早期视网膜血管病变在一定程度上类似于糖尿病性视网膜病变的早期改变,但未发现明显的视网膜缺血无灌注区域。可能有如下原因：VEGF的浓度和刺激时间不足；极周边部视网膜即使出现上述病变，造影时的角度、动物麻醉时的眼位固定状态也可能影响造影时观察，难以发现。实验结果显示高浓度组2wk时视网膜内核层血管内皮细胞肥大，血管管腔面积减少。我们推测这种改变影响组织的血液供应，导致视网膜的缺血。因此可能引起的OPs改变先于a，b波的改变。因此我们选择OPs的总波幅作为观察指标。结果显示高浓度组2wk时SAOPs降低，说明血管内皮细胞肥大，毛细血管管腔变窄导致了视网膜缺血。

    VEGF作为一种重要的促进新生血管形成因子，已被人们所认识。VEGF的明胶微球置于猕猴的视网膜下后，视网膜下新生血管的形成率为92％。Alikcacem等[6]将VEGF缓释装置置入兔的玻璃体腔，诱导的视网膜病变与增殖性糖尿病视网膜病变类似。Tolentino等[7]认为VEGF诱导的猕猴视网膜出血、水肿、静脉串珠、毛细血管闭塞、微血管瘤、视网膜内血管组织增生等视网膜病变类似于糖尿病性视网膜病变和其他缺血性视网膜病变。采用ADPase染色的方法，证明周边部眼底存在视网膜前新生血管[8]。VEGF诱导猴视网膜血管内皮细胞肥大亦有报道[9]。本研究显示：低浓度作用，玻璃体视网膜血管病变不明显。高浓度短时间（2wk）作用可以诱导视网膜内核层毛细血管内皮细胞肥大，管腔面积减少。高浓度较长时间（6wk）可以诱导血管内皮细胞增生。高浓度长时间作用（12wk）可以出现视网膜内血管内皮细胞增生，管腔面积接近闭塞，玻璃体视网膜纤维血管样组织。但是，在高浓度作用4wk时，诱导的病变仅限于视网膜血管曲张，视网膜内核层的毛细血管管腔、血管内皮细胞未出现变化。我们推测在rrVEGF164作用2wk至6wk之间，也就是血管内皮细胞从肥大到增生的演变过程中，存在某种更替机制。可能在2wk时外源性的rrVEGF164对血管内皮细胞处于作用阶段，表现为细胞代偿性肥大。在4wk时玻璃体腔外源性的rrVEGF164的浓度不足以再起刺激作用。在6wk或更晚期阶段，在先期阶段外源性的rrVEGF164作用下，内源性的机制被启动，而表现为血管内皮细胞增生，甚至玻璃体视网膜纤维血管样组织增生。

    产生视网膜前新生血管，必须要有足够强度的刺激因素（如VEGF），而且要具备足够的刺激时间。视网膜层间的血管内皮细胞增殖可以认为是视网膜内新生血管形成的征象，但是这种新生血管因为相对静止，不会产生渗漏等改变，因此不同于视网膜前、视网膜下的新生血管，它的临床意义不大。我们推测早期的血管内皮细胞肥大，血管管腔面积减少，影响视网膜局部血液供应，视网膜水肿，局限性缺血、缺氧，导致视网膜功能发生改变，视网膜电图振荡电位总波幅降低。但是rrVEGF诱导的这种视网膜血管内皮细胞肥大的确切原因、病理意义，视网膜血管内皮细胞形态、数目的动态变化有待更深层次的研究。

    【参考文献】

    1 Burgons R, Simo k, Andi L, Mateo C, Mesal J, Garcia-Ramirez M, Carrascosa A. Vitreous levels of vascular endothelial growth factor are not influenced by its serum concentrations in diabetic retinopathy. Diabetologia ,1997;40(9):1107-1109

    2 Dureau P, Bonnel S, Menasche M, Dufier JL, Abitbol M. Quantitative analysis of intravitreal injections in the rat. Curr Eye Res ,2001;22(1):74-77

    3 Hayashi A, Kim HC, de Juan E Jr. Alterations in protein tyrosine kinase pathway following retinal vein occlusion in the rat. Curr Eye Res ,1999;18(3): 231-239

    4 D'Amato R, Wesolowski E, Smith LE. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res ,1993;46(2):135-142

    5 Bresnick GH, Palta M. Oscillatory potential amplitudes. Relation to severity of diabetic retinopathy. Arch Ophthalmol ,1987;105(7):929-933

    6 Alikacem N, Yoshizawa T, Nelson KD, Wilson CA. Quantitative MR imaging study of intravitreal sustained release of VEGF in rabbits. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2000;41(6):1561-1569

    7 Tolentino MJ, Miller JW, Gragoudas ES, Jakobiec FA, Flynn E, Chatzistefanou K, Ferrara N, Adamis AP. Intravitreous injections of vascular endothelial growth factor produce retinal ischemia and microangiopathy in an adult primate. Ophthalmology ,1996;103(11):1820-1828

    8 Tolentino MJ, Mcleod DS, Tanomoto M, Otsuji T, Adamis AP, Lutty GA. Pathologic features of vascular endothelial growth factor-induced retinopathy in the Nohuman primate. Am J Ophthalmol ,2002;133(3):373-385

    9 Hofman P, van Blijswijk BC, Gaillard PJ, Vrensen GF, Schlingemann RO. Endothelial cell hypertrophy induced by vascular endothelial growth factor in the retina. Arch Ophthalmol ,2001;119:861-866

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