3　讨论

　　RDS小鼠视网膜的光感受器细胞外节发育异常，然后光感受器细胞缓慢变性死亡，其病理改变过程与人视网膜色素变性极其相似［5］。Travis采用消减杂交法从6～7周的C57BL/6小鼠minus6～7周的rd/rd小鼠视网膜文库中首次分离了正常小鼠的野生型RDS/peripherin基因的全长度cDNA克隆，并且发现RDS/RDS小鼠存在RDS/peripherin基因缺陷。基因第2外显子(cDNA序列中第899位核苷酸)插入了约10　kb的外源性基因片段，导致编码的蛋白产物C端的87个氨基酸残基被截断［6］。把正常拷贝数的RDS/peripherin基因插入到RDS小鼠后，观察到正常光感受器细胞外节的形成，在形态学上未发现光感受器细胞变性的征象［7］。动物实验结果提示：RDS/peripherin是视网膜变性的候选基因。

　　在视网膜色素变性［8］、黄斑营养不良［9］等患者中相继发现了RDS/peripherin基因突变。连锁分析同样提示：RDS/peripherin基因可能是视网膜变性疾病的候选基因。但目前对RDS/peripherin基因的正常功能和突变基因的致病机制知之甚少。为了进一步探讨RDS/peripherin基因在体外、　体内对光感受器细胞的作用，本研究克隆了大鼠RDS/peripherin基因，为研究视网膜变性的致病机制和治疗奠定了物质基础。

　　图4　克隆的SD大鼠RDS/peripherin基因的cDNA序列(下划线：阅读框架)及与文献报道的序列(斜体)的比较［1］。

　　Fig.4　Sequences of colned RDS/peripherin cDNA of SD rat(underlined:reading frame)as compared with that reported in literature(italics)［1］.

　　根据小鼠、人、牛、大鼠的cDNA序列，预测相应RDS/peripherin蛋白的氨基酸序列，发现同源性为85%，其中大鼠和小鼠同源性为97.1%［10］。根据这一特点，我们参照从Gene　Bank中查询到的大鼠RDS/peripherin全长度的cDNA序列，设计并合成了引物，以SD大鼠的polyA+RNA为模版，采用RT-PCR的方法成功地扩增了大鼠RDS/peripherin　cDNA。测序结果与Begy等报道的相应序列［1］相比较，除3′端非翻译区的序列有所不同外，5′端非翻译区和编码区序列完全相同。不同的序列是：①本研究中第1　242位碱基为G，而文献报道为A。②第1　409～1　411位的碱基为CCA，而文献报道为CA，减少了一个碱基C。分析出现不同序列的可能原因是：①PCR扩增过程中出现碱基错配。本研究采用了Expand　High fidelity PCR system替代Taq DNA聚合酶，它是Taq DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶一定比例的混合物。因为Pwo　DNA聚合酶对错配的碱基具有3′～5′的外切酶活性，所以碱基错配率由Taq DNA聚合酶的2.6×10-5下降为8.5×10-6，最大限度地减少了碱基错配的可能性。②测序过程中出现碱基错配。我们通过多次测序，对重叠部分进行比较，排除了这种可能性。③RDS/peripherin　cDNA序列存在多态性。上述不同序列的碱基位于3′端非翻译区，因此并不影响编码蛋白产物的结构。

　　大鼠RDS/peripherin基因的成功克隆，为进一步深入研究RDS/peripherin基因的作用奠定了良好基础。RDS/peripherin基因在真核细胞中的表达和作用的研究正在进行之中，我们将另文报道。

　　志谢　湖南医科大学肿瘤研究所的曹亚教授，湖南医科大学附二院中心实验室的吴轰教授，华西医科大学遗传室的夏庆杰讲师，眼科分子生物学研究中心的敬慧娥、刘戟、张文老师在课题研究中所给予的无私帮助

　　本课题受国家自然科学基金(基金号39670772)和中国博士后科学基金资助

　　4　参考文献

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　　[4]　萨姆布鲁克 J，弗里奇E.F，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指导.金冬雁，译．第二版.北京：科学出版社，1992.34-57.

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　　[8]　　Kajiwara K,Hahn LB,Mukai S,et al.Mutation in the human retinal degeneration slow gene in autosomal dominant retinitis pigmentosa.Nature,1991,354:480-483.

　　[9]　Piguet B,Heon E,Munier FL,et al.Full Characterization of the maculopathy associated with an Arg-172-Trp mutation in the RDS/peripherin gene.Ophthalmic Genet,1996,17:175-86.

　　[10]　Travis GH,Christerson L,Danielson PE,et al.The human retinal degeneration slow(RDS)gene:chromosome assignment and structure of the mRNA.Genomics,1991,10:733-739.

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