【摘要】 促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是促进骨髓红系祖细胞增殖和分化的主要刺激因子，安全治疗肾性贫血已有20a的历史。近年来，有研究表明在人和动物的神经系统EPO不仅是一个新的神经递质，而且是一个新的有发展前景的神经保护剂。这种由其受体（EPOR）介导的神经保护作用已在多发性硬化，急性视网膜缺血再灌注，急性视神经损伤，慢性高眼压等大量的动物模型的体内外实验中得到证实。但其机制及相关的信号转导途径还有待于深入研究，其衍生物的发现也为临床新药物的开发提供了新的方向。
【关键词】 促红细胞生成素;促红细胞生成素受体;神经保护;信号转导途径；衍生物
目前认为青光眼性视功能下降是由于视神经/视网膜神经节细胞功能减退或凋亡引起。视网膜神经节细胞死亡是青光眼视神经损伤的最终共同通路。逆转视网膜神经节细胞凋亡过程或减轻视网膜神经节细胞的凋亡程度是研究青光眼治疗方式的一个重要方向。另一方面，神经营养因子的剥夺被认为是激活青光眼中视网膜神经节细胞凋亡并导致视网膜神经节细胞丢失的原因。近期发现，促红细胞生成素在神经保护方面有显著作用。因此了解其作为神经营养因子是如何发挥神经保护作用及其相关的机制能为视神经保护治疗提供新的思路。
1 EPO和EPOR的分子结构
多功效因子促红细胞生成素（erythropoietin， EPO）是一种含唾液酸的糖蛋白，分子量34kDa，来源于成人的肾脏和胎儿的肝脏。人类EPO基因由166个氨基酸残基组成，其生物学活性是通过靶细胞膜表面的受体介导的[1,2]。EPOR由杂受体复合体组成，包括经典受体(EPOR)2（erythropoietin receptor）2和βcR (common β receptor)亚基[3]。人EPOR由8个外显子和7个内含子构成，编码相对分子量66kDa，由507个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，其结构可分成三部分：胞外区，跨膜区和胞内区。胞内区缺乏酪氨酸激酶的特征排序，不具备酪氨酸激酶活性。近膜区有两个高度保守的序列Box1和Box2[4]， Box1是EPOR与酪氨酸激酶相关联的部位，与EPOR形成折叠有关。胞外区具有4个半胱氨酸残基和色氨酸丝氨酸x色氨酸丝氨酸结（WSXWS）,x代表任一氨基酸。高度保守的近膜区的WSXWS结构是胞内激素受体配基结合位点的必须组成部分，起到与EPO特异结合的作用[5]。其中，促进骨髓造血的作用是通过与(EPOR)2结合而发挥[3]。而其神经保护作用则是通过与βcR亚基结合发挥[3],此亚基能增加配体与受体复合物结合的亲和力，亦是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子IL3,IL5的信号转导成员[6]。
2 EPO,EPO衍生物和EPOR的分布和产生
近年的研究发现脑、卵巢、输卵管、子宫和睾丸均可分泌EPO[7]。在很多部位如脊髓中心灰质神经元、脑、脉络膜血管神经的网状组织、室管膜细胞、神经胶质、心肌细胞、毛细血管均可共表达(EPOR)2和βcR。与(EPOR)2相比，βcR不仅分布在神经元的胞体还表达在树突[8]。在人和啮齿类动物的大脑中EPO和EPOR主要分布在海马及大脑皮层中的神经元和神经胶质细胞。深入研究发现EPO和EPOR在神经元和星形胶质细胞均有表达，小胶质细胞仅有EPOR的表达，少突状胶质细胞无表达[9,10]。EPO亦可在中枢神经系统损伤的人的脑组织和脑脊液中检测到[11,12]。对缺血性脑梗塞死后的患者进行脑组织检查发现，与功能正常的脑组织相比，损伤部位EPO,EPOR表达增加;在新梗塞部位，梗塞中心周围的脉管系统高发区也有EPO的表达;EPOR则高表达于梗塞周围区域的神经干和突起，以及梗塞中心破碎的神经纤维。提示EPO对缺血的神经元有直接的保护作用[12]。然而，除缺血、缺氧外,其他原因如低血糖、炎症反应等也可诱发脑组织高表达 EPO[13]。BckerMeffert等[14]视网膜移植的研究中发现，EPOR在鼠视网膜多层均有表达。但其主要表达在神经节细胞层，低密度染色标记存在于内，外丛状层和锥体内节部分。但并未发现EPOR表达于Müller细胞。而在慢性高眼压大鼠模型研究中发现，EPO主要由Müller细胞产生，在正常的视网膜组织主要分布在神经纤维层和内丛状层。随着眼压的升高，2wk后EPO扩大表达在内核层，外丛状层和外核层。同时观察到，在正常视网膜组织EPOR主要分布在内丛状层，少量分布在神经节细胞层。眼压升高2wk后神经节细胞层EPOR表达量增加，内核层也有少量表达，而外核层无表达。与正常的视网膜EPOR表达量相比增加了3倍。此外，用荧光金逆行标记视网膜神经节细胞(retinal ganglial cells,RGCs)及应用特异抗体作为细胞标记物发现，绝大多数的RGCs表达EPOR在神经节细胞层[15]。发现EPO具有神经元保护功能的早期阶段，人们认为其不能通过血脑屏障。因此实验研究EPO的体内作用时，都采用脑内注射的方式。近来有研究发现[16]，在大脑的毛细血管内皮细胞上存在EPOR，与EPO结合后以胞饮的方式通过血脑屏障后发挥作用。同时，亦有研究证明EPO能通过血视网膜屏障起到保护作用[17，18]。新近成功地从EPO分离出来的asialo EPO和carbamylated EPO有着和EPO相同的神经保护作用。与rhEPO相比，虽然asialoEPO半衰期较短，却依然能与EPOR结合；氨甲酰化的carbamylated EPO仅与βcR结合，失去EPO在血液系统中的作用，但二者却可以避免产生EPO相关的副反应，对其深入地研究很有价值[3]。
3 EPO神经保护作用的信号转导途径
3.1细胞信息转导 细胞信息转导是多细胞生物体对信息物质应答引起生物学效应的重要过程。信息转导过程包括：特定的细胞释放信息物质→信息物质经扩散或血循环到达靶细胞→与靶细胞的受体特异结合→受体对信号进行转换并启动靶细胞信使系统→靶细胞产生生物学效应。生物间信息物质有蛋白质，多肽等。细胞内的信息物质有无机离子、脂类、糖类衍生物、环核苷酸和信号蛋白（如蛋白激酶）。信息传递并非独立，而是交叉联系，构成错综复杂的调节网络。正常的信息传递是正常代谢与功能的基础，信号传递环节异常则导致疾病的发生[19]。
3.2转导途径 EPO和EPOR结合后，EPOR分子形成二聚体，使与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的碘化酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK2磷酸化后又激活下游的信号转导因子。其中STAT5激活后可刺激线粒体产生抗凋亡蛋白，如BclXl,从而抑制细胞色素c释放的caspases活化酶的活性。而同样具备SH2结构域的PI3K激活后则通过下游转导因子AKT的活性对凋亡产生抑制作用[2022]。同时，EPO和EPOR的相互作用也会激活ras/MAPK途径及NFκB,后者为一种正常状态下与配偶体IκBα结合并以非活性状态存在于细胞核外的因子。JAK2和NFκB之间信号通路的交叉感知也参与EPO抗凋亡的信号转导，此途径可抑制NFκB磷酸化，使NFκB移入核内转录凋亡抑制因子xIAP和cIAP,从而抑制凋亡。然而这种交叉感知的信号途径仅在神经细胞中观察到，所以有学者认为这两种信号途径可能与神经元特异蛋白密切相关[23,24]。进一步确认此观察结论及寻找神经元特异蛋白成为研究神经元信号转导途径的新挑战，而现有的理论依据也会帮助学者们寻找其他交叉存在的信号转导途径。Maiese 等[25]认为EPO的神经保护作用是通过保证细胞的完整性和阻止细胞感染完成的。而证实这种保护作用与抗感染能力亦与JAK2和AKT的信号转导有关。启动的细胞信号转导因子包括FOXO3a, Bad, GSK3beta, BclXl, NFκB, caspases, APAF1。EPO的抗感染作用并非是感染细胞产生EPOR。相反，EPO是通过受损的神经元组织趋化信号的表达，即EPO的抗感染作用继发于其神经保护作用。而发生感染的同时，局部的EPO产量会下降，外源性EPO的给予尤为重要。此外，EPO也能通过抑制谷氨酸兴奋毒性、NO毒性，抗氧化作用以及刺激新生血管形成起到神经保护作用[26]。同时有研究发现，SHPTP1这一负性调节因子也参与了信号转导。SHPTP1平时以非活性状态存在于胞质中，当EPO和EPOR结合后，活化JAK2,使SHPTP1的结合位点即为与胞内部分的受体的第429位酪氨酸磷酸化，SHPTP1活化后使JAK2去磷酸化，从而终止信号转导[27]。
3.3 EPO发挥神经保护作用时细胞信号转导实验研究 Kilic等[28] 在研究tg21 转基因大鼠EPO的神经保护作用时发现，和野生鼠相比，tg21鼠视网膜高表达于人EPO。EPO的应用显著增加RGCs的存活密度。离断tg21鼠视神经后，ERK1/2和AKT磷酸化水平显著提高，而JNK活性轻度降低，caspase3活性受到抑制。应用PI3K/AKT途径抑制剂却未影响RGCs的存活，提示EPO在tg21鼠诱导的神经保护作用依赖于激活ERK1/2途径而并非PI3K/AKT途径。然而Weishaupt等[29]在大鼠轴突损伤模型中，用一种PI3K激酶抑制剂WM可抑制AKT的激活，进而抑制EPO的神经保护作用。同时用Western blot和免疫组化的方法研究EPO在体内的信号转导途径，却发现PI3K/AKT信号途径是EPO在体内抗凋亡的主要信号途径，并未发现ERK1/2途径起作用。这可能是由于种属的差别造成的信号通路的不同。Sttler等[30] 在多发性硬化鼠模型中也发现全身给予EPO可通过PI3K/AKT途径保证RGCs的存活。Chong 等[31] 在研究阿尔茨海默疾病中发现，暴露于β淀粉状蛋白（Abeta）时，有效浓度的EPO可抑制其毒性引起的凋亡反应，从而有效抑制毒性造成基因组DNA的完整性缺失和细胞膜的不对称性。其中，EPO的神经保护作用和NFκBp65的表达密切相关，此途径可抑制Abeta蛋白的降解，通过NFκBp65向核转移而启动抗凋亡程序。Kretz 等[32] 体外培养视神经损伤后的成年大鼠RGCs，通路研究表明抑制JAK2/STAT3途径，EPO促进神经轴突生长作用被抑制。在EPO抗凋亡和促进神经再生作用中，有PI3K/AKT途径参与，同时上调Bclxl亦能促进RGCs再生。Zhang等[22]在短暂大脑缺血引起的海马区神经元死亡的模型中，发现EPO调节的神经保护作用是由STAT5途径转导的。证实给予EPO可以提高STAT5磷酸化水平，从而进一步激活下游的基因产物，Bclxl和XIAP。同时，一种JAK2选择性抑制剂酪氨酸磷酸化抑制剂可阻断STAT5和其下游基因的激活。说明JAK2是STAT5的上游信号转导基因。但有实验表明体内的EPOR有饱和性，高浓度的EPO会引起EPOR的快速下调，以至不能转导EPO的神经保护信号[33]。Agnello 等[34]在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）动物模型的研究中发现，每日腹膜内给予EPO 500～5000U/kg,可推迟EAE症状发作时间。EAE可诱导脊髓产生高水平的IL6和TNF，分别于病程10d和12d达峰浓度。而EPO只降低IL6的水平，提示是否与EPO和IL6竞争相同受体有关。以上对EPO的研究均为下一步眼的急慢性损伤模型中的EPO发挥神经保护作用时的信号转导通路研究奠定了基础，可以看出不同的动物种属，不同的模型，起主要神经保护作用的通路也会不同。
4 EPO衍生物的神经保护作用
Leist等[3]的研究证实carbamylated EPO能防止P19神经细胞的凋亡；抑制由NMDA诱发的海马细胞凋亡；在大脑中动脉梗塞模型中推迟4h给药依然有神经保护作用；在脊髓损伤模型中，推迟48～72h给药神经保护作用仍有效，且神经保护作用与EPO等效。在自身免疫性脑脊髓炎模型中仍有神经保护作用，且不引起红细胞增生副作用[35]。同样，在脊髓损伤，大脑中动脉阻塞引发的脑组织局部缺血，坐骨神经损伤模型中，asialo EPO亦有神经保护作用[36]。在由肌萎缩性侧索硬化症引发的运动神经变性上，carbamylated EPO和asialo EPO有着显著的体内外神经保护作用，然而这种作用不引起BDNFmRNA量的增加，在此方面与EPO不同[37]。然而亦有研究发现在亨顿氏疾病鼠模型中，asialoEPO没有神经保护作用，归因于这是一种慢性神经损伤疾病，而此种疾病亦有翻译过程处缺陷，抑制asialoEPO神经保护作用时的信号转导[38]。但在慢性高眼压鼠模型中EPO的神经保护作用却得以证实[15]，基于asialo EPO与EPO与相同受体结合，说明慢性损伤性疾病不是致使asialo EPO在亨顿氏疾病鼠模型中无保护作用的主要原因。
5 EPO在眼部的神经保护作用
Junk 等[39]建立的视网膜缺血再灌注鼠模型中，缺血72h后EPOR在视网膜的表达达峰值，是对照组的4倍。而EPO在缺血48h后表达却开始下降，同时观察到在缺血24h前或缺血同时给予EPO治疗则有助于视网膜功能的恢复。缺血7d后观察EPO处理组视网膜内层厚度和组织结构明显优于对照组。由此可见，EPO通过减少炎症反应和抗凋亡的作用在中枢和外周神经系统中发挥神经保护作用。Lavail等[40]发现在视网膜色素变性的大鼠模型中,视网膜周边的感光细胞由于氧充足而较多保留，提示视网膜色素变性过程中感光细胞处于低氧状态。而EPO是缺氧时HIF1诱导生成的主要因子，起视神经保护作用[41]。Grimm等[42]在研究EPO对视网膜光化学变性的保护作用时发现，HIF1在缺氧时诱导EPO生成，低氧预处理可通过干预caspase1活性来阻止光化学作用诱导的凋亡过程，保护视网膜的正常功能和形态。在慢性高眼压大鼠模型中，EPO亦能发挥神经保护作用。研究发现，向玻璃体内注射可溶性的EPOR，眼压升高2wk后，与对照组相比，RGCs生存率下降近50%。基于外源性的EPOR可中和体内的EPO，上述现象提示眼压升高后内源性的EPO/EPOR系统可能参与内在的恢复机制的修复过程。同时发现，在造模24h或30min前给予外源性的EPO，在眼压升高2wk后，RGCs存活率与造模前相比没有变化，提示外源性的EPO有明显的神经保护作用[15]。体外培养视神经损伤后的RGCs,培养液中加入10～10000U的EPO，与未加入EPO的对照组相比，神经细胞数量增加到2.66倍，轴突长度增长到8.31倍。进一步说明EPO可提供神经保护和促进轴突生长的双重作用[31]。BckerMeffert等[14] 亦发现EPO在体外具有促进视网膜神经轴突生长的作用。近来Zhong等[43]在体外培养视网膜神经细胞时发现,EPO的保护作用与其剂量和作用时间有关。培养液中加入1000，3000，6000U/L 3种浓度的EPO对神经细胞的轴突生长和对抗5.0，10.0mmol/L两种浓度的谷氨酸的毒性作用均有不同效应。其中，仅3000，6000U/L的EPO可抵抗10mmol/L的谷氨酸产生的早期细胞凋亡效应。而3种浓度的EPO对谷氨酸产生的晚期细胞凋亡效应均无保护作用。同时，作用48h后6000U/L浓度的EPO有明显的促进轴突生长的作用，与对照组相比，增长62.8%。同时，King 等[44]也发现EPO促神经轴突生长及神经保护作用呈时间和剂量依赖关系。Sttler等[30]在多发性硬化鼠模型中发现，给于鼠5000U/kg的EPO，视神经损伤后1d观察有77%的RGCs存活，而7d后仅有55%的RGCs存活。亦提示EPO的神经保护作用呈时间依赖性。同时观察到，给予2000U/kg的EPO，其神经保护作用与对照组无明显区别;而给予10000U/kg的EPO,RGCs的存活量则明显增加。Weishaupt等[29]建立的大鼠轴突损伤模型，用免疫染色的方法分别于轴突损伤后1，2，5，7，14d观察RGCs上的EPOR的表达，与体外实验不同，发现EPOR在损伤后RGCs上的表达与时间无关。同时，发现体内应用EPO有抑制轴突损伤的作用，其神经保护作用与剂量呈钟型反应曲线关系，即在一定范围内，EPO的神经保护作用随其剂量的增加而提高，而过高剂量的EPO会抑制其神经保护作用。
6展望
综上所述，EPO在不同的动物模型中，不同的实验条件下均具有神经保护作用。然而，由于高浓度长时间应用可引起红细胞增多症、血小板聚集、血栓症、促进肿瘤生长等不良并发症，其作为神经保护剂应用于临床还需耐心等待。而asialoEPO和carbamy lated EPO的分离为EPO的副作用提供了解决方案，二者在神经保护方面的具体应用还需进一步实验研究得到论证。同时，由于信号转导途径受多种因素的调控，所以对EPO发挥神经保护作用时的复杂的信号转导途径网络及其相互作用机制目前还不是很清楚。比如，EPOR的激活所引发的信号转导途径同样是胰岛素，胰岛素样生长因子等其它因子共有的信号转导途径，所以EPO的应用等于间接激活了共享此途径的其它因子的受体，是不是这些因子也参与了神经保护过程呢？诸如此类的问题还有待于深入地研究。而此领域的深入研究，将会为相关临床治疗提供新的药物靶点。特别是EPO在眼部的神经保护作用的深入探讨将会为视神经损伤疾病这一眼科学难题的临床治疗开辟一条新的道路。
【参考文献】
1 Oda A, Sawada K, Druker BJ, et al. Erythropoietin induces tyrosine phosphorylation of JAK2, STAT5A, and STAT5B in primary cultured human erythroid precursors. Blood 1998；92(2):443451
2 Sawyer ST, Penta K. Association of JAK2 and STAT5 with erythropoietin receptors. J Biol Chem 1996;13;271(50):3243032437
3 Leist M, Ghezzi P, Grasso G, et al. Derivatives of erythropoietin that are tissue protective but not erythropoietic. Science 305 (2004) 239242
4 Jiang N, He TC, Miyajima A, et al. Box1 domain of the erythropoietin receptor specifies janus kinase 2 activation and functions mitogenically within an interleukin2 F0 receptor chimera. J Biol Chem 1996;271(28): 1647216476
5 Yoshimura A, Zimmers T, Neumann D, et al. Mutations in the TrpSerXTrpSer motif of the erythropoietin receptor abolish processing, ligand binding, and activation of the receptor. J Biol Chem 1992;267(16):1161911625
6 DAndrea RJ, Gonda TJ. A model for assembly and activation of the GMCSF, IL3 and IL5 receptors: insights from activated mutants of the common beta subunit. Exp Hematol 2000;28(3):231243
7 Lappin T. The cellular biology of erythropoietin receptors. Oncologist 2003;8(Suppl 1):1518
8 Brines M, Grasso G, Fiordaliso F, et al. Erythropoietin mediates tissue protection through an erythropoietin and common betasubunit heteroreceptor. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101(41):1490714912
9 Nagai A, Nakagawa E, Choi HB, et al. Erythropoietin and erythropoietin receptors in human CNS neurons, astrocytes, microglia, and oligodendrocytes grown in culture. J Neuropathol Exp Neurol 2001;60(4):386392
10 Wang J,Chu G.The protective effects of EPO on nerve tissues. Foreign Med Sci Sect Pathophysiol Clin Med 2004;24(3):214216
11 Marti HH, Gassmann M, Wenger RH, et al. Detection of erythropoietin in human liquor: intrinsic erythropoietin production in the brain. Kidney Int 1997;51(2):416418
12 Sirén AL, Knerlich F, Poser W, et al. Erythropoietin and erythropoietin receptor in human ischemic/hypoxic brain. Acta Neuropathol 2001;101(3):271276
13 Jelkmann W, HellwigBurgel T. Biology of erythropoietin. Adv Exp Med Biol 2001;502:169187
[1] [2] 下一页 |
