视网膜超微结构研究的灌流固定技术
眼科研究 2000年第4期第18卷 技术方法
作者：姚小莉 罗子国
单位：罗子国（400042重庆医科大学）；姚小莉（研究生，现在成都市第二人民医院610017）
在医学生物学领域内用透射电镜观察组织超薄切片是目前应用最多也是最基本的方法，取材的正确与否与制备出的标本能不能符合观察的要求有直接的关系，而良好的固定对于获得具有完整的微细结构信息也是十分重要的。对豚鼠视网膜的实验研究发现，采用灌流固定技术，较以往的先取材后浸泡固定的方式对视网膜特别是视细胞和色素上皮细胞的形态及各种细胞器的空间关系保存更好，现总结报道如下。
1 材料与方法
1．1 灌流液配制 冲洗液：0.9%NaCl500ml＋0.25g肝素。固定液：2.5%戊二醛，使用前需经活性炭过滤。灌流装置：将装有冲洗液和固定液的玻璃瓶分别悬挂于距动物心脏平面1.1～1.25m高处，连接输液器备用。
1．2 灌流固定 动物全麻后仰卧于操作台，开胸暴露心脏，将连接生理盐水的7号针头直视下穿进左心室，剪破右心房放血。冲洗5min左右至流出的是淡血水为止，换2.5%戊二醛灌流固定15～20min。
1．3 取材及电镜标本制备 按常规摘取眼球，沿睫状体平坦部或赤道部环切，将带有视网膜的后半眼球壁以视乳头为中心切为4块，每块切取1mm宽的长条，或按实验要求选部位取材，再浸泡固定2h后用0.1mol/LpH7.4的磷酸缓冲液漂洗6h，1%四氧化锇后固定2h，酒精丙酮逐级脱水，环氧树脂定向包埋。作1μm厚半薄切片，0.5%甲苯胺蓝染色，光镜定位，超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铝染色后即可用于透射电镜观察。
2 结果
灌流结束时，动物四肢肌肉收缩僵直，脏器黄硬，眼球壁微凹。电镜下观察，视网膜各层结构清晰，视细胞膜盘排列整齐层次分明，细胞器无肿胀，空间关系保存良好，神经上皮层和色素上皮层无分离。这些均为固定良好的表现特征。
3 讨论
视网膜属于神经组织，结构精细而脆弱，新陈代谢旺盛，对缺血缺氧极为敏感，因此，对视网膜标本的制取要求十分严格。灌流固定时，固定剂通过血液循环，由视网膜各层的毛细血管网迅速到达视网膜全层的细胞和间质，达到组织被切取以前即已充分固定的目的，和以往的先取材后浸泡固定方式相比较，对视细胞和色素上皮的固定更为充分，形态结构保存更好，可以避免先取材过程中的人为损伤和组织自溶，且不受环境温度的影响。特别是在一些特殊的研究中，要求对视网膜不同部位的定位选材，灌流固定技术更能显示其优越性。 |
