【摘要】目的：探讨睑板腺癌nm23表达及与其临床病理学特点的关系及影响预后因素。方法：免疫组化分析nm23在正常睑板腺与睑板腺癌的表达及其与临床病理学特征间的关系。临床随访，根据原始记录和随访反馈，对临床组织病理各因素统计。结果：正常组及肿瘤组均有nm23的表达且位于细胞膜上，肿瘤组nm23表达明显强于正常组（P＜0.05）。且nm23表达量与睑板腺癌发病年龄、病程长短、肿瘤分化程度、转移情况明显相关（P＜0.05）。睑板腺癌转移与浸润明显相关（P＜0.05）。结论：高nm23表达量可能预示肿瘤低分化及低转移率。提示nm23表达与睑板腺癌的发生发展密切相关，检测nm23有助于评估病情、判断预后。
【关键词】 睑板腺癌 nm23 免疫组织化学 组织病理学
0引言
睑板腺癌属于恶性程度很高的恶性肿瘤，发病率居眼睑恶性肿瘤第二位(约占32.7%)[1]。该肿瘤易复发、转移，转移率居眼睑肿瘤的首位，对放化疗不甚敏感。目前已发现nm23与多种恶性肿瘤浸润和转移密切相关，是公认具有抑制肿瘤转移功能的基因。因此该研究期望通过深入研究nm23，探讨nm23与睑板腺癌发生、发展及预后的关系，结合临床资料及随访结果，进一步了解该肿瘤发病特点及寻找预测其预后的参考指标。
1对象和方法
1.1对象 收集我院198401/200609睑板腺癌样本60例，患者48例，所有患者均经病理学证实。选择手术切除睑板腺癌病理蜡块标本60例，正常睑板腺蜡块20例作为对照组。每个标本制成4μm厚切片3张，一张用于HE染色再次确诊及病理学分类，一张用于免疫组化染色检测nm23的表达，一张用PBS液代替一抗作空白对照。试剂：nm23H1鼠抗人单克隆抗体（NM301），由美国SANTA CRUZ生物技术公司提供。超敏SP（鼠/兔）试剂盒及DAB显示剂（DAB0031），由福州迈新生物技术开发有限公司提供。
1.2方法
1.2.1免疫组化染色 SP法，石蜡切片常规脱蜡，柠檬酸缓冲溶液高压3min，冷却20min对组织抗原修复，滴加过氧化物酶阻断液及正常非免疫动物血清，室温孵育10min。依次分别加入一抗（nm23H1 1:40），4℃过夜。生物素标记的二抗，室温孵育30min。以及链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液，上述各步骤均以0.01mol/L PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，透明封片。
1.2.2结果判定 光镜观察细胞质染色为棕黄色颗粒状为nm23阳性表现。
1.2.3采集、分析图像 采用OLYMPUS cx31系统采集图片，每张HE及免疫组化染色切片随机选4个400倍视野，各取图片一张。利用图像分析软件IPP 6.0（ImagePro Plus 6.0）对免疫组化染色400倍图片进行分析。随机选一张400倍图片作为标准，进行图片MOD值（平均光密度值）测量，求其平均值用表示图片染色强度。
1.2.4整理临床资料 根据患者病历记载及病理记录，临床随访（写信及电话），有条件者建议到医院复查。根据原始记录和随访反馈情况，即术后复发时间及次数、术后侵犯、转移情况，对睑板腺癌临床组织病理各因素整理。
统计学分析：采用秩和检验和Logistic回归模型。
2结果
2.1临床资料分析 在60例肿瘤样本中，≥60岁32例（53%），<60岁28例（47%），发病年龄多在60～69岁。男39例（65%），女21例（35%），男女比例1.86∶1。上睑39例（60%），下睑26例（40%），其中同时侵犯上下睑5例，上下睑比例1.5∶1。左右眼比例1.2∶1。根据肿瘤大小分两组，直径≥10mm组50例，直径＜10mm组10例。根据Font（1986）等病理学分类标准分：低分化12例，中分化20例，高分化 28例。从出现明显表现到我院就诊病程0.5mo～12a，平均33.9mo。其中≥6mo 48例，＜6mo 12例。出现复发者38例（63%），未复发者22例（37%）。局部浸润20例（33%），多浸润眼眶、眼肌肉、角结膜等，未浸润者40例（67%）。根据病历记载及随访结果，发生转移者16例（27%），含耳前淋巴结转移5例，颌下淋巴结转移6例，其他部位（腮腺、脑、鼻等）5例。未转移者44例（73%）。手术情况：局部肿块切除44例，眶内容剜出13例，眼球摘除3例。术后5例放疗，2例冷冻治疗。随访情况：12例（25%）回复随访，随访时间2～21(平均6.4)a。其中8例无复发、转移，随访时间平均8.2a；4例在手术后3a复发，其中3例出现转移，2例因全身转移死亡。其余患者因病历不全或已搬迁、已死亡未回复随访。
2.2影响睑板腺癌预后临床因素分析 肿瘤复发与患者年龄、性别、部位、肿瘤大小、病程、分化程度、转移、浸润均无明显相关（P＞0.05）。肿瘤浸润与转移明显相关(P＜0.05)，即发生浸润的睑板腺癌患者出现转移的可能性较未侵犯者大；而上述其他因素与转移、浸润无明显相关（P＞0.05）。
2.3 nm23H1在睑板腺癌中的表达 正常睑板腺与睑板腺癌中均有nm23H1的表达且均位于细胞膜上，呈棕黄色颗粒状（图1，2），两组染色强度存在差异，差异有统计学意义（P＜0.05），睑板腺癌组所测值较正常组高。且低、中、高分化组nm23H1表达存在差异，差异有统计学意义（P＜0.05）。低分化表达高于高、中分化(P＜0.05)，尚不能认为高、中分化程度表达量有差异(P＞0.05)。Logistic回归模型多因素分析：年龄、病程、分化程度、转移情况对nm23H1表达量有影响（P＜0.05）。其表达量同发病年龄正相关，同病程长短、分化程度、转移率负相关。而性别、发病部位、肿瘤大小、复发、浸润与nm23H1表达无明显相关（P＞0.05）。
3讨论
3.1睑板腺癌临床特点及治疗 睑板腺癌发病年龄多在50～70岁之间，女性略多于男性，通常上睑是下睑两倍，左右眼无区别。发病缓慢病程长，有明显的浸润性，可侵犯结膜或眼眶，癌细胞可转移到耳前，颌下或腮腺淋巴结。本次实验采用的标本均经病理学确诊，其中男女比例1.86∶1，年龄33～80岁，多在60～69岁，上下睑比例为1.5∶1。病程平均33.9mo，其中＜6mo 12例，≥6mo 48例。除男性所占比例较大外，均与国内作者有关睑板腺癌发病特点报道一致[2]，因此本组患者及标本能很好反映睑板腺癌中nm23的分布、表达情况及睑板腺癌发病特点。目前睑板腺癌治疗仍以手术切除为主，放化疗为辅的综合治疗。对于放疗的作用，以往认为放疗无效。Yen等[3]认为放疗有效，剂量应>55Gy，对于一些小的肿瘤，可试用冷冻治疗。本组患者5例术后放疗，其中2例肿瘤转移后死亡， 3例至今未出现复发及转移。2例术后多次冷冻治疗，1例效果佳，1例肿瘤多次复发。考虑可能与肿瘤的恶性程度相关。建议对较局限、低恶性的睑板腺癌及有手术禁忌证或局部切除术后复发者，可以在术后酌情放疗或冷冻[3，4]，改善睑板腺癌预后。
3.2 nm23与睑板腺癌预后因素分析 本实验表明睑板腺癌复发与患者年龄、性别、部位、肿瘤大小、病程、分化程度、转移、浸润均无相关。而Rao等[5]认为睑板腺癌侵犯上下睑、低分化、多中心起源、病程超过6mo、肿瘤直径>10mm、眼睑有派杰样病损表现、血管淋巴管及眶内有肿瘤侵犯者，肿瘤易复发。这与本研究结果不相一致。也有文献报道睑板腺癌预后与其分化程度负相关，中、低度分化的睑板腺癌预后较高分化睑板腺癌要差。本实验高分化组中，部分患者出现复发，而在中、低分化组中部分患者并未出现复发，统计学结果也未显示分化程度差异所致预后状况的不同，从而说明影响睑板腺癌复发的因素可能是多方面的。有报道睑板腺癌的转移与肿瘤发生位置有关，因耳前淋巴结收纳上睑及眶周的淋巴回流[5] ，所以发生在上睑及眶周的睑板腺癌转移率较高，易转移至耳前、颌下及腮腺淋巴结。尽管本实验表明睑板腺癌转移与发病部位无显著关联，但从临床角度分析，睑板腺癌发病部位与转移两者可能存在一定内在关系。本实验随访结果：出现转移的肿瘤患者5a存活率为33.33%，这与其他相关研究中的结果一致（30%）[6]。本研究因随访人数较少，尚需加大随访量作进一步分析。
3.3睑板腺癌nm23的表达及意义 目前发现人类nm23家族成员达到9个，肿瘤的转移抑制功能主要由 nm23H1体现。nm23H1基因定位于人类17号染色体（17q21.3～22），长度为18kb，含有 5个外显子。编码蛋白的分子质量分别为18.5KDa和17KDa，主要位于细胞质。nm23家族的蛋白产物具有二磷酸核苷激酶（NDPK） 活性，NDPK通过乒乓机制将二磷酸核苷（NDP）转变成除ATP以外的三磷酸核苷（NTP），维持体内NDP和NTP平衡。NDPK主要参与微管的聚合/解聚及G蛋白介导的信号传导。nm23蛋白的改变，使微管聚合异常，引起减数分裂时纺锤体异常，导致癌细胞染色体非整倍体形成，促进肿瘤发展。NDPK第二个功能是在信号传导过程中使GDP还原为GTP，使G蛋白激活，推测 nm23基因以此方式调节G蛋白介导的信号传导反应，参与肿瘤进展转移[7]。近年研究表明nm23的转移抑制功能与组氨酸激酶（histidine kinases）活性也有关。
图1 正常睑板腺组织（SP×400）（略）
图2 睑板腺癌（低分化SP×400）（略）
本实验表明：正常睑板腺及睑板腺癌细胞膜中均有nm23H1的表达，且肿瘤组表达量明显高于正常组。国内学者通过原位杂交也发现肿瘤组 nm 23 mRNA表达明显强于正常组，中低分化者nm23mRNA表达水平也明显高于高分化者[8]。说明 nm 23 mRNA阳性表达与睑板腺癌的发生有关， nm 23 mRNA增高与睑板腺癌细胞分化不良正相关，这与nm23H1抑制肿瘤转移功能相矛盾。推测可能在不同类型肿瘤及肿瘤不同发展阶段，nm23H1作用不同，调控机制和表达水平上有所不同，在实验研究和临床所观察到的nm23H1表达与各种肿瘤发生、发展关系不尽相同。本实验同时表明：nm23H1的表达量同睑板腺癌发病年龄正相关；同病程长短、分化程度、转移率负相关。高nm23表达量可能预示肿瘤的低转移率，这与其他肿瘤相关研究结果一致。有研究检测非小细胞肺癌和正常肺组织中 nm 23H1mRNA表达量，发现 nm 23H1mRNA表达下降抑制细胞的分化，加速淋巴结转移[9]。且nm23H1高表达与子宫内膜癌、葡萄膜黑色素瘤的低淋巴结转移率有关[10,11]。因此nm23H1可能是预测睑板腺癌预后转移的指标，但尚需加大样本量作进一步分析。
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