【摘要】目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和肌肽（carnosine）对中期保存角膜内皮细胞(corneal endothelial cell,CEC)活性的影响。方法：角膜中期保存液保存兔角膜，对照组为角膜中期保存液，实验组分为A，B，C组，分别为角膜中期保存液中加入bFGF (20μg/L)、肌肽（5g/L）、bFGF (20μg/L)+肌肽（5g/L），在保存角膜3，7，14d观察角膜大体形态，台盼蓝茜素红联合染色检测CEC活细胞率，扫描电镜及透射电镜检测细胞超微结构改变。结果：保存3d，各实验组角膜大体形态、CEC活细胞率及超微结构改变与对照组相比无显著差异；保存7，14d，各实验组角膜大体形态、CEC活细胞率及超微结构改变均优于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，其中以A，C组CEC活性最好。结论：在角膜中期保存液中加入bFGF和肌肽，均可以提高保存CEC的活性，但与bFGF相比，肌肽的保护作用相对较弱。
【关键词】 内皮细胞 角膜 细胞存活 成纤维细胞生长因子 肌肽 抗氧化
0引言
随着角膜移植技术的广泛开展，眼库越来越需要高效、稳定、经济适用的角膜保存液以提高角膜活性和延长保存时间，增加角膜移植手术的成功率。bFGF具有促进细胞增殖、分化，减少细胞损伤凋亡的作用，角膜中期保存液中加入bFGF具有良好效果，保存的动物CEC显示出较高生物活性。肌肽是一种天然非酶促自由基清除剂和抗氧化剂，具有抗氧化、抗糖基化、调节酶活力、保护膜完整性等生理功能。角膜保存液中加入抗氧化剂具有积极作用，据此我们推测肌肽可能对维持CEC活性有一定保护作用。我们在角膜中期保存液中加入bFGF和肌肽，通过对角膜大体形态、CEC活细胞率、超微结构等检测，比较研究bFGF和肌肽对延长角膜保存时间和提高保存角膜质量的作用。
图1 CEC台盼蓝茜素红染色光镜观察（×20）（略）
A：对照组 3d；B：实验A组 7d；C：对照组 7d；D：实验B组 14d；E：对照组 14d
1材料和方法
1.1材料 自制角膜中期保存液，基本成份：4.725g/L MEM 4.725g/L TC199，25g/L硫酸软骨素、10g/L低分子右旋糖酐(相对分子质量40000)、链霉素、HEPES缓冲液等，加四蒸水调整pH为7.2～7.4，渗透压为290～300mmol/L，抽滤除菌并将角膜保存液分装成每瓶20mL，标明配置日期，密封于4℃冰箱备用。2～3月龄纯种新西兰健康白色家兔(新疆医科大学实验动物中心提供) 36只，体质量1.5～2.5kg，雌雄不限，于裂隙灯下检查眼前节（）者可纳入实验。用生理盐水、氯霉素眼药水冲洗结膜囊3次，750mL/L乙醇和碘伏消毒眼睑周围皮肤，从耳缘静脉注入空气10mL栓塞处死后立即摘除双眼眼球，清水冲洗掉血迹，彻底修剪眼球表面的附属组织，包括结膜、肌肉、浅层的球筋膜以及过长的视神经。处理好的眼球置入1∶2000的庆大霉素生理盐水溶液中浸泡消毒20min，再用生理盐水冲洗。随后移入超净工作台，在严格无菌状态下，先用眼科刀片在角膜缘外2mm处对巩膜作一环形划痕，然后以角膜剪沿此划痕剪开巩膜，用睫状体分离器剥离睫状体，将虹膜从角膜内皮面轻柔撕除，即制备成带2mm巩膜沿的完整角膜片，将其内皮面朝上（注意勿损伤角膜内皮）。
1.2方法 对照组为角膜中期保存液，实验组（AC组）分别为角膜中期保存液中加入20μg/L bFGF(珠海億胜生物制药有限公司)、5g/L肌肽（Sigma公司）、20μg/L bFGF+5g/L肌肽。每组6只角膜片。每天观察保存液的颜色变化及混浊程度，3，7，14d取出角膜前在超净台内抽取各组保存液4mL，送做细菌和真菌培养。观察角膜是否透明，有无水肿、混浊、皱褶等。
1.2.1兔CEC活性检测 采用台盼蓝茜素红联合染色法。将2.5g/L台盼蓝（Sigma公司）染色液滴于角膜内皮面上，染色4 min后用生理盐水漂洗净染液，用滤纸吸干周围水分，再滴上10g/L茜素红（天津大茂化学试剂公司）染液，染色4 min后用生理盐水漂洗净染液，用滤纸吸干周围水分，置于光学显微镜低倍下观察CEC全貌并照相，然后每个标本于40倍显微镜下分别随机取5个不同视野进行观察，在显微镜的目镜内放置网格片，每个视野100个细胞，以细胞核明显蓝染或茜素红斑为细胞死亡标志，进行计数并取平均值，计算活细胞率（ESR）。ESR=[(CEC总数非活细胞数)/细胞总数]×100%。
1.2.2兔CEC超微结构观察 取角膜片置于40g/L预冷的戊二醛磷酸缓冲固定液中固定制备电镜切片，行CEC透射电镜和扫描电镜观察并照相。
统计学分析：所有数据采用SPSS 13. 0统计软件处理，实验结果以均数±标准差表示，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析（OneWay ANOVA），组间多重比较采用LSDt检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
角膜保存液在保存过程中液体澄清，均未见混浊及絮状沉淀。送检样本，菌检均为阴性。保存3d，实验各组与对照组角膜均透明，无明显水肿增厚；保存7d，对照组角膜轻度水肿、混浊、增厚，实验各组角膜基本透明，无明显水肿增厚；保存14d，对照组角膜明显水肿增厚，透明度差；实验各组角膜亦有不同程度水肿增厚，但透明度尚好，其中实验A组与C组角膜透明度最好，水肿增厚最轻。角膜保存3d，对照组及实验各组CEC六角形边界清晰，间质呈粉红色，核无蓝染（图1A）。角膜保存7d，实验各组CEC形态基本正常，仅有少许细胞核蓝染（图1B）；对照组CEC轻度肿胀，六边形边界较模糊，核蓝染细胞较实验组增多（图1C）。角膜保存14d，实验各组CEC轻度水肿、六角形结构存在、排列较整齐、部分细胞核蓝染（图1D）；对照组CEC水肿、融合、边界不清晰、六角形结构基本消失、细胞核明显蓝染（图1E）。角膜保存3d，实验各组与对照组CEC活细胞率均较高，组间比较差异均无统计学意义。随着保存时间的延长，对照组角膜CEC活细胞率较实验各组逐渐下降，保存角膜7，14d实验各组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0. 01)，组间多重比较显示实验A组和C组CEC保存效果较好( P<0.01，表1)。组间多重比较LSDt检验：角膜保存3d后，各组间多重比较均无显著性差异；角膜保存7，14d后，各组间多重比较示实验组（A，B，C组）与对照组均有显著性差异（P＜0.01），实验组内A组和C组与B组比较亦有显著性差异（P＜0.01），而A组和C组比较无显著性差异。
图2 14d CEC超微结构变化（SEM×2000）（略）
A：实验A组；B：实验B组；C：对照组
图3 14d CEC超微结构变化（TEM×20000）（略）
A：实验B组；B：对照组
扫描电镜观察,实验A，C组CEC形态基本一致，呈六边形镶嵌状规则排列，连接紧密，Y型连接无明显断裂，细胞表面微绒毛短，数量少，胞体大，核突起明显（图2A），B组可见CEC呈较规则的六边形镶嵌结构，连接较紧密，细胞融合及Y型连接断裂并存(图2B)。对照组CEC大量坏死，坏死区无明显细胞结构，存活CEC明显肿胀，形态不规则，并有细胞融合，Y型连接断裂，胞膜不完整，胞质裸露(图2C)。透射电镜观察,实验各组保存14d，CEC的包膜完整，胞体较大，胞质丰富，胞质内有少量空泡，可见少量线粒体水肿、内质网轻度扩张，常染色质多，胶原纤维排列整齐(图3A)；对照组CEC变性坏死现象明显，胞膜不完整，细胞质有大量空泡形成，线粒体严重肿胀，内质网明显扩张，胶原纤维排列不整，胞质内可见髓样结构，细胞核固缩，提示内皮细胞严重受损，细胞活性明显下降(图3B)。
3讨论
中期保存法是目前最常用的角膜保存方法，是用活性保存液在4℃低温条件下使CEC活性保持4～14d以至更长时间[1]。Optisol液为目前世界各国公认的较理想的中期保存液，我国主要依靠进口，因价格昂贵，限制了国内的推广使用。目前尚无商业化的国产角膜保存液，为了适应我国角膜移植的需要，不断完善角膜保存技术，需要在这方面进行深入的研究。
表1 对照组与实验各组CEC的活细胞率比较（略）
大量的文献资料证实，bFGF有利于提高角膜保存质量，延长保存时间[2]，为我国中期角膜保存技术带来了新的突破口，也为进行相关方面的研究提供了一个新的平台。Rieck等[3]在角膜保存液中加入bFGF,保存动物角膜取得了良好效果，研究发现加入bFGF能促进CEC的有丝分裂，减少CEC的损伤凋亡，改善CEC的代谢和受损细胞的修复。阎超等[4]研究发现bFGF和表皮生长因子(EGF)在角膜中期保存液中均有促进细胞增殖、保持角膜细胞活性的作用，以bFGF作用更明显。徐智勇等[5]研究发现中期保存液中加入bFGF，角膜水肿较轻、透明度较高，CEC形态结构和活性较好。另外该研究还对角膜中期保存液中bFGF的不同质量浓度对保存角膜细胞活性的影响作了进一步分析，结果发现兔角膜中期保存液中添加bFGF的质量浓度以20～50μg/L为宜[6]。
研究证明角膜为最易受氧化损伤的组织之一。当角膜在低温液体内保存时，细胞代谢仍在进行，氧化过程中所产生的超氧阴离子、过氧化氢及羟自由基不断聚集，使细胞膜的不饱和脂质过氧化,降低膜的流动性，影响生物膜的完整和稳定，使CEC的活性不断下降[7,8]。于莉等[9]研究发现透明质酸钠联合抗氧化剂（还原型谷胱甘肽和VitC）有减轻角膜组织损伤，保持细胞活性的作用，可显著提高保存效果。屈晨等[10,11]在角膜中期保存液中加入一定量硒或VitE，证实能够提高内皮细胞的抗氧化能力，延长角膜的保存时间。众多研究表明角膜保存液中加入抗氧化剂可以减轻自由基和脂质过氧化反应，对角膜保存有—定的积极意义，据此我们推测具有抗氧化活性的天然物质肌肽可能对维持CEC活性具有一定保护作用。肌肽是一种天然非酶促自由基清除剂和抗氧化剂，具有抗氧化、抗糖基化、调节酶活力、保护膜完整性、螯合金属离子、质子缓冲、调节巨噬细胞功能和神经递质作用等生理功能。韩立强等[12]研究表明肌肽能够减少超氧阴离子的生成，减少脱氧核糖降解产物的生成，抑制红细胞的氧化溶血和降低肝匀浆脂质氧化产物的生成。Williams等[13]研究发现使用肌肽滴眼液能够减轻未成熟白内障的晶状体混浊程度。孙熠等[14]研究发现，肌肽能有效抑制糖皮质激素诱导的晶状体混浊,并且显著抑制糖皮质激素诱导的Na+K+ATP酶失活。
提高角膜保存质量和延长角膜保存时间，关键在于延缓角膜细胞，特别是CEC在体外保存的死亡过程，尽可能长时间维持细胞的正常生理功能[15]。我们在自制角膜中期保存液中加入外源性的bFGF和肌肽，比较研究保存3，7，14d的角膜大体形态、CEC活细胞率及超微结构改变等，探讨bFGF和肌肽对角膜中期保存的作用。大体观察是最直观的检查手段，主要依靠观察角膜片的厚度、是否水肿来评价CEC的状况。本实验显示，随着保存时间的延长，角膜透明度逐渐下降，水肿增厚，保存14d，对照组明显水肿增厚，透明度差；实验各组角膜亦有不同程度水肿增厚，透明度尚好，其中实验A组、C组角膜透明度最好，水肿增厚最轻。台盼蓝茜素红联合染色光学显微镜观察，是检测CEC活性的经典方法，台盼蓝能通过受损、死亡的细胞膜使细胞核着染成淡蓝色，茜素红可与细胞间隙中的钙结合发生红染，正常活性的角膜内皮细胞六角形边界清晰，间质呈粉红色，严重损伤的内皮细胞轮廓不清，边界模糊，胞核明显蓝染。本实验中，实验各组保存的角膜内皮细胞形态较好，核蓝染细胞较少，实验各组与对照组CEC活性率相比差异均有统计学意义(P<0.01)，组间多重比较显示实验A，C组CEC活性率最高，保存效果最好( P<0.01)。扫描电镜和透射电镜可以观察CEC的亚细胞结构，是对CEC深层次的研究。我们对保存14d的对照组及实验各组CEC进行观察，实验各组CEC形态基本一致，连接紧密，细胞表面微绒毛存在，胞膜完整，胞质丰富，细胞器轻度水肿、扩张，超微结构显示明显优于对照组。
总之，本实验证实在角膜中期保存液中加入bFGF(20μg/L)与肌肽(5g/L)保存兔角膜，在角膜大体形态、CEC活细胞率、CEC超微结构等方面均优于对照组，证实bFGF与肌肽对CEC有一定保护作用，但与bFGF相比肌肽的保护作用相对较弱。此外，肌肽对CEC的保护作用机制、肌肽与其他药物联合应用等问题均需要进一步研究，肌肽的作用效果仍需大量实验研究及临床应用来验证。
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4阎超,王立,潘志强.碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对角膜中期保存液保存人CEC的影响.中华眼科杂志 2006;42(2):166170
5徐智勇,赵敏,李鸿,等.保存液中添加bFGF对中期保存角膜细胞活性的影响.重庆医科大学学报 2004;29(1):1114
6徐智勇,赵敏,李鸿,等.角膜中期保存液添加bFGF的质量浓度分析.眼科研究 2007;25(4):329331
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9于莉,高维奇,刘平,等.透明质酸钠联合抗氧化剂中期保存兔角膜.眼科新进展 2007;27(10):746749
10屈晨,盛敏杰,历曙光,等.硒对中期保存的兔CEC的影响.同济大学学报医学版 2003;24(5)：1618
11屈晨,盛敏杰,林安娟,等.VitE对中期保存的兔CEC的影响.同济大学学报医学版2005;26(6):378380
12韩立强,杨国宇,王艳玲,等.肌肽清除自由基及抗氧化性质的作用研究.河南工业大学学报自然科学版 2006;27(1):4346
13 Williams DL, Munday P. The effect of a topical antioxidant formulation including Nacetyl carnosine on canine cataract: a preliminary study. Vet Ophthalmol 2006;9(5):311316
14孙熠,严宏.肌肽对糖皮质激素诱导白内障形成和Na+K+ATP酶失活的保护作用.国际眼科杂志 2006,6(3):519522
15钟兴武,龚向明,杨培增,等.角膜中期保存过程中细胞凋亡的研究.中华眼科杂志 2000;36(2):147149 |
