【摘要】 目的：研究高浓度葡萄糖诱导人LECs凋亡以及LEDGF对LECs凋亡的影响。方法：采用终浓度为5.56，11.11，22.22mmol/L葡萄糖处理体外培养的LECs，诱导建立LECs凋亡模型。用终浓度为200ng/mL的LEDGF抗体进行干预。利用流式细胞仪对LECs凋亡情况进行检测。结果：流式细胞仪检测发现随着葡萄糖浓度增高，LECs凋亡百分率亦呈升高趋势，不同组间差异有显著性。LEDGF抗体能够增加由高糖引起的LECs凋亡百分率。结论：高浓度葡萄糖可在体外诱导兔LECs凋亡。LEDGF可保护LECs并减少其凋亡的发生。
【关键词】 凋亡 晶状体上皮细胞 高糖 晶状体上皮源生长因子
0引言
白内障是糖尿病最常见的眼部并发症之一。Takamura等[1]根据糖尿病大鼠模型出现LECs凋亡推测凋亡可能由高糖引起，这提示抑制LECs凋亡是控制糖尿病性白内障的一个有效策略。近年来，晶状体上皮源生长因子(lens epitheliumderived growth factor，LEDGF)以其优越的抗（外）环境应激能力受到诸多学者瞩目[2]。本实验通过高糖诱导建立LECs凋亡模型，并进一步研究LEDGF抗体在LECs凋亡过程中所发挥的作用，以探讨糖尿病性白内障的发病机制。
1材料和方法
1.1材料 试剂：美国GIBco BRL公司的DMEM培养基，制成含200mL/L胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）培养液；AnnexinvFITC凋亡检测试剂盒；人LEDGF亲和纯化抗体（Biosis公司）。仪器：美国BectonDickinson公司FACSort型流式细胞仪；日本OLYPUS公司AU2700型全自动生化分析仪；EMM型倒置相差显微镜和C35OLYMPUS型照相机；37℃ 50mL/L CO2培养箱。人LECs系（HLEB3）：哈尔滨医科大学组织工程与发育生物学研究中心提供。
1.2方法
1.2.1细胞培养 细胞培养于200mL/L胎牛血清的DMEM中，置于37℃ 50mL/L CO2培养箱中培养并进行传代、消化、种瓶、换液。将对数生长期的LECs悬液调整细胞密度为5×104/L接种于96孔无菌培养板中，每孔200μL。
1.2.2 LECs细胞诱导凋亡模型的建立 模型的制作：设立空白对照组，然后通过全自动生化分析仪将培养液葡萄糖终浓度分别调定成5.56mmol/L组（作为正常生理组），11.11mmol/L组和22.22mmol/L组。设定诱导时间为12，24，36h。凋亡的评价：流式细胞仪测定LECs凋亡百分率。选取诱导凋亡模型最满意的一组作为高糖模型组进行后续实验。
1.2.3“抗LEDGF”实验 将LEDGF抗体（100μg）用PBS依1∶100稀释，分装待用。向所选取的高糖模型组施加LEDGF抗体。根据Nakamura等[3]设定浓度值，即将培养液LEDGF抗体终浓度调定成200ng/mL，该组为抗体干预组。作用时间分别为12，24，36h。流式细胞仪测定LECs凋亡百分率。
统计学分析：所有实验结果采用±s表示，进行方差分析和t检验，以P＜0.05为显著性标准。
2结果
2.1 LECs凋亡的诱导 模型制作和凋亡的评价参见我们早期的工作[4]。11.11mmol/L葡萄糖浓度诱导的LECs凋亡百分率较典型，并且其细胞坏死率也较低，故选其作为高糖模型组进行后续实验。
2.2 LEDGF对高糖诱导凋亡LECs的保护作用 通过比较抗体干预组与高糖模型组发现，前者LECs凋亡百分率更大，并且随着时间的延长，两者LECs凋亡百分率差别愈加明显（表1）。
3讨论
1998年，Singh等[2]从LECs基因文库中分离出一个cDNA克隆，它能编码一种新的生长和生存因子，该因子被命名为LEDGF。LEDGF表达水平的提高可使诸如热休克蛋白、抗氧化蛋白和解毒酶等应激相关蛋白家族的水平提高，从而抑制了由应激引起的凋亡[5]。国内尚无LEDGF的相关实验报道。LECs对晶状体的生长发育以及正常生理状态的维持至关重要。近年来研究提示LEC凋亡可能是人类和动物非先天性白内障的共同细胞学基础[5]。
表1 LECs凋亡百分率的比较（略）
aP＜0.05，bP＜0.01，cP<0.05,dP<0.01 vs高糖模型组
本实验以高浓度葡萄糖作为凋亡诱导因素，观察其对体外培养LECs的影响。结果显示高浓度葡萄糖可诱导体外培养的LECs发生凋亡，为进一步探究糖尿病性白内障与LECs凋亡的关系提供了必要的依据。正常LECs表达LEDGF很少，但在应激情况下可表达增加，从而提高LECs抗应激能力。正常晶状体上皮细胞内无LEDGF抗体表达，只有在自身免疫性疾病中才会出现[6]。本实验通过施加LEDGF抗体，人为地减少LECs在抗应激（高糖）时LEDGF的表达。结果显示尽管正常表达LEDGF（而非过表达）的LECs（高糖模型组）在高糖条件下仍发生凋亡，但其凋亡率远低于LEDGF抗体干扰组，且这种差别随时间推移愈加明显，这表明LECs正常表达或在应激状况下过表达LEDGF对LECs有重要保护作用。
LEDGF作为生存因子（survival factor），其相对减少可能是糖尿病性白内障发生的原因之一，保持其正常表达对防治糖尿病性白内障是非常必要的。由于本实验作用时间设定较短，因此今后对LEDGF的长效性和量效变化尚需进一步研究。
【参考文献】
1 Takamura Y, Sugimoto Y, Kubo E, et al. Immunohistochemical study of apoptosis of lens epithelial cells in human and diabetic rat cataracts. Jpn J Ophthalmol 2001；45(6):559563
2 Singh DP, Ohguro N, Kikuchi T, et al. Lens epitheliumderived growth factor:effects on growth and survival of lens epithelial cells, keratinocytes, and fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun 2000;267(1):373381
3 Nakamura M, Singh DP, Kubo E, et al. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000;41(5):11681175
4曲利军,金迪,齐艳华,等.胰岛素对高浓度葡萄糖诱导凋亡晶状体上皮细胞的保护作用.国际眼科杂志 2008;8(12):24352437
5曲利军，齐艳华.晶状体上皮源生长因子的基础与临床.中国实用眼科杂志 2004;22(1):510
6 Muro Y, Sugiura K, Morita Y, et al. High concomitance of disease marker autoantibodies in antiDFS70/LEDGF autoantibodypositive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus 2008;17(3):171176 |
