【摘要】 目的：探讨5羟色胺（5hydroxytryptamine,5HT）在豚鼠近视离焦模型形成中的作用。
方法：将24只4周龄的豚鼠分成2组，离焦组（18只36眼），包括离焦实验眼（右眼，戴接触镜）和离焦对照眼（左眼，未戴接触镜）；空白对照组（6只12眼）除检查外不做任何干预。将PMMA接触镜配戴在离焦组豚鼠右眼前，自然光下饲养14d后除去镜片,建立近视离焦模型。近视离焦模型建立后，分别处死实验组及空白对照组豚鼠，取出眼球,分离出视网膜、脉络膜及巩膜组织。用高效液像色谱电化学检测法测定视网膜、脉络膜及巩膜组织中5HT含量。
结果：在豚鼠视网膜、脉络膜、巩膜内均有5HT存在，其中脉络膜中含量最高，其次为巩膜及视网膜；离焦实验眼视网膜、脉络膜及巩膜中5HT含量明显升高(P＜0.01）；与离焦对照眼及空白对照组相比较差异显著（P＜0.05）。
结论：5HT可能参与了离焦性近视的形成。
【关键词】 离焦性近视 5羟色胺 豚鼠 效液像色谱 电化学检测法
0引言
近视眼是人类常见眼病之一，在普通人群中患病率很高，全世界平均患病率为25%～40%；我国是近视眼的高发地区，根据1998年在北京顺义地区以人群为基础的调查，15岁男、女学生近视眼的患病率分别达37.6%和55%[1]。长期以来，随着人类文明的发展，近视眼的发病率不断上升，一些严重的并发症可以导致失明，在世界各地近视致盲率占第4～6位，因此防治近视已成为世界性共同关心的问题。虽然对近视防治的研究已有200a历史，提出过多种假说，但是近视眼的发病机制尚不明确，因此探讨近视眼发病机制，从病因上治疗近视眼是眼科工作者要解决的关键问题。5羟色胺（5hydroxytryptamine, 5HT）是一种神经递质，存在于中枢及周围神经系统，眼内5HT对眼有很大的影响，它提高眼内压，收缩眼内血管，促进有丝分裂，改变视网膜无长突细胞生理过程。有研究发现鸡形觉剥夺近视眼模型5HT的代谢产物含量明显减少，推测5HT可能作为一种神经递质参与了形觉剥夺近视的形成，但具体作用机制尚不清楚[2]。本研究试图通过检测豚鼠实验性近视离焦组与对照组视网膜、脉络膜及巩膜内5HT含量是否有差异来探讨5HT在离焦性近视形成中的表达。
1材料和方法
1.1材料
德国Moller2102手术显微镜、美国Waters公司液相色谱仪,510高压泵、U6K进样器、 Wchers464电化学检测器、玻璃碳电极、Millennium色谱工作站、5羟色胺（Aldrich）、3,4二羟卞胺 (Sigma)、超声波细胞破碎机(德国drhhielscher UP2000H)高速离心机（美国 Lkb公司）。将24只4wk龄的豚鼠随机分成2组，离焦组（18只36眼），包括离焦实验眼（右眼，戴接触镜）和离焦对照眼（左眼，未戴接触镜）；空白对照组（6只12眼）除检查外不做任何干预。
1.2方法
1.2.1动物模型制作
PMMA接触镜的配带：将PMMA接触镜（镜片直径13.5mm,光学区直径10.5mm,基弧9.6mm，屈光度10.00D）配戴在健康4wk龄的三色豚鼠（由中国医科大学实验动物中心提供）右眼前，作为离焦实验眼。饲养温度维持在20～25℃,光照与黑暗周期比为12h∶12h,专用豚鼠饲料,专人饲养。白天隔2h观察豚鼠一次，若镜片脏，用棉签清理干净；若镜片脱落则及时固定。14d后除去镜片。本实验符合 Helsinki 宣言的要求，并得到中国医科大学伦理委员会的批准和实验动物中心的认可。表1 两组视网膜、脉络膜及巩膜内5HT含量比较（略）
1.2.2实验标本的制备
动物模型制作好后分别处死实验组及空白对照组豚鼠，立即取出眼球,无菌操作，手术显微镜下锯齿缘处切开眼球，将前段眼组织和玻璃体除去，虹膜恢复器快速分离出视网膜、脉络膜及巩膜组织，快速置于灭菌的Eppendorf管中，标号后快速放入液态氮中保存，冷冻后移入70℃冰箱中储存待用。
1.2.3高效液像色谱测定视网膜、脉络膜及巩膜内5HT含量
将离焦组18只豚鼠（包括离焦实验眼18眼和离焦对照眼18眼）及空白对照组6只豚鼠（12眼）的视网膜、脉络膜及巩膜利用高效液像色谱测定其中5HT含量。色谱条件：BDS C18色谱柱(大连依利特色谱公司)250mm×4.6mm,电极电压0.7V,缓冲液:3mmol/L庚烷磺酸钠,100mmol/L醋酸钠,85mmol/L柠檬酸,0.2mmol/L EDTA,调PH=3.7,流动相∶缓冲液甲醇(体积比92∶8),流速:1.0mL/min。溶液配制：(1)标准溶液配制，将上述标准品用0.1mol/L高氯酸,配成质量浓度为1g/L的储备液,分析时用流动相稀释成1ng/L混合液；(2)内标溶液配制按配制标准溶液的方法,配制内标物质3,4二羟卞胺（DHBA）溶液,使其质浓度为4mg/L；(3)样本提取溶液配制，0.1mol/L高氯酸，内含5μL内标溶液。用精密电子称先称Eppendorf管重量，取离焦组18只豚鼠（实验眼18眼，对照眼18眼）及空白对照组6只豚鼠（12眼）的冰冻视网膜、脉络膜及巩膜组织标本，每个标本作为一个样品，置入上述已称重的Eppendorf管内，再称出管加样品的重量,减去样品重量,即得到样品的湿重。样品称重后加入95μL 0.1mol/L高氯酸及5μL的内标溶液，在冰浴上超声匀浆，于2000r/min离心15min，取上清20μL进样分析。取水溶液,分别加入5羟色胺(5HT)2，5，40，400μg/L，按样品处理方法操作后，以5HT浓度为横坐标，以反应峰高值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。计算方法：根据标准品的色谱分析，参照标准品的峰高大小及所测样品的峰高大小进行比较，确定其含量。
统计学处理：采用均数差异t检验的方法对空白对照组与离焦实验组及离焦对照组之间5HT含量结果进行差异的显著性分析。采用SPSS11.4软件。
2结果
标准曲线结果表明，5HT浓度在5～100μg/L范围内有良好线性关系：r=0.9991（图1）。豚鼠正常眼中,视网膜、脉络膜、巩膜内均有5HT存在，其中脉络膜中含量最高，其次为巩膜及视网膜。离焦眼中，视网膜、脉络膜及巩膜内5HT含量均明显增加（P＜0.01）；实验组对照眼与空白对照组相比较无明显差异（P＞0.05，表1）。
3讨论
近视眼发病机制尚不十分明确，目前无有效的病因学方面的治疗方法。实验性近视虽是一种实验室所诱导的近视形式，但由于其结构和屈光特点与人类自发的近视非常相似，切其实验条件容易控制，常被用来作为人类近视的研究。形觉剥夺和离焦诱导均可使小鸡、树鼠、豚鼠及幼猴产生眼轴过度延长及近视性屈光不正[36]。以往研究近视眼动物模型多用小鸡，因为小鸡近视模型周期短，易于建立，价格便宜。但是小鸡巩膜包含两层，即软骨层、纤维层，哺乳动物巩膜是由纤维层构成，豚鼠为哺乳动物纲，与人眼巩膜结构相似，来源容易，因此近年来多用豚鼠作动物模型。一般通过形觉剥夺[3，7,8]（Form Deprivation）或离焦[9]（lens induce）来诱导实验性近视眼。有研究表明,各种动物出生后,眼球存在主动的正视化过程,其中最有说服力的例证是眼对透镜离焦所作出的代偿性眼球生长变化[1014 ]，表明正视化过程是有视觉依赖的,因此对豚鼠离焦近视机制的研究有利于对人类近视眼机制的探讨。本研究通过建立豚鼠近视离焦模型，研究近视眼的发病机制，以寻找有效的治疗方法。
二十世纪四十年代后期发现5 HT，10a后，在动物的中枢神经系统发现它的存在，并且有神经递质功能。五十年代末，在周围神经系统发现不同基因的5 HT受体。 5 HT在眼内也有神经元或受体。眼内5HT对眼有很大的影响，它改变视网膜无长突细胞生理过程，提高眼内压，收缩眼内血管，促进有丝分裂。实验性近视眼形成过程中，会发生视网膜、脉络膜及巩膜的相应改变。5HT免疫反应定位在视网膜内核层的无长突细胞体的小集团里。George等[15]研究的数据表明5HT对离焦近视模型有刺激作用，高剂量5HT有抑制作用；离焦模型眼球视网膜内含5HT的无长突细胞含量提高12.5%。本研究利用高效液像色谱测定离焦实验组、离焦对照组及空白对照组豚鼠视网膜、脉络膜及巩膜内5HT含量，发现豚鼠视网膜、脉络膜及巩膜内均含有5HT，其中脉络膜最高，其次为巩膜和视网膜，且离焦实验组视网膜、脉络膜及巩膜内5HT含量明显一致性增加。我们推测，5HT参与了豚鼠离焦近视的形成，且起到刺激近视形成的作用。
【参考文献】
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