1．3候选基因突变位点的检测根据已报道的中国家系致病基因突变位点(9个基因的16个突变位点)，应用Primer Premier 5．0软件设计11对引物(表1)。引物由上海英骏公司合成。PCR反应体系为25一，含10 X PCR缓冲液2山，25 mmoVL Mgcl21．6一，2mmoL／L dNllP 1．2山，10 oanmoL／L正反向引物各0．8山，0．5U／山Taq DNA聚合酶2一，20ng／一基因组DNA 2山，双蒸H2 O 10．4山。上述试剂购自QIAGEN公司。PCR反应程序采用手工热启动以及逐步降温PCR技术。PCR产物经电泳检测后，通过ABl3130 DNA测序仪测序。

1．4微卫星分子标记连锁分析

1．4．1微卫星分子标记的选择根据已报道的17个ADCC候选基因和13个染色体区域，选取物理距离与上述位点紧密连锁的27个微卫星分子标记(有些基因／染色体区域距离非常接近，可以共用1个标记)，用于家系遗传连锁分析，引物序列来自基因组数据库(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov)。荧光引物由上海英骏公司合成。

1．4．2 PCR反应反应体系lO斗l，含10×PCR缓冲液1斗l，25 mmoL／L MgCl2 0．4灿l，2 mmoVL dNTP
1．2出，正反向引物浓度及体积根据扩增效率不同分子标记作适当调整，5 u／山热启动Taq DNA聚合酶
0．1斗l，20 ng／“基因组DNAI山，添加双蒸H20至10 m。上述试剂均购自QIAGEN公司。PCR反应程序为95℃预变性15min，第1相循环：94℃308，起始退火温度63℃90 s，以后每个循环下降0．50C，72℃60 s，共16个循环；第2相循环：89。C 30s，550C 90s，72℃60 S，共20个循环，最后60℃延伸30min。其中
第1相循环的起始退火温度和循环数根据扩增效率不同标记作适当调整。

1．4．3 基因型分析PCR产物经ABl3130自动测序仪毛细管电泳(5％变性聚丙烯胺凝胶分离)，使用
ABI ROXS00标准样品测量各等位基因片段的大小，应用GeneSean 3．0和Genotyper 2．1软件进行数据
收集和基因分型。

1．4．4连锁分析根据每个微卫星标记在家系成员中的基因分型结果。应用LINKAGE 5．2软件中的
MLINK进行微卫星标记与候选基因和位点两点间的连锁分析，计算优势对数值(109 of the odd ratio，
LOD)。

2结果

2．1候选基因突变位点的检测将家系中ADCC患者与正常成员的11个PCR产物DNA测序结果作比对，仅发现2个单核苷酸多态性(SNP)，但不影响氨基酸编码，故将其排除。即在所测序的DNA片段上未发现突变位点，排除了已报道的中国家系致病基因突变位点(9个基因的16个突变位点)。

2．2微卫星分子标记连锁分析因所选取的标记与候选基因非常接近(均<2 Mb)，所以仅计算重组率(0)=0．01、0．02、0．03时的LOD值。结果见表2。在27个微卫星分子标记中，有4个(D20S917、D2S2164、D15S117、D6S309)LOD值=0，可能是因缺失数据过多，软件无法计算。D16S3040和D15507的LOD值介于一2一1．Ol，需要继续调查积累家系资料再运算。其余有21个LOD值<一2，提示无连锁信息，提示所选取的27个微卫星分子标记与该家系致病基因均不连锁。

3讨论

先天性白内障是一种因胚胎期品状体代谢异常而导致其自身透明度下降的疾病。任何参与、影响晶状体发育的基冈突变都町导致先天性白内障的发生11引。随着分子遗传学的发展，与ADCC相关的基因或染色体区域被相继定位。迄今为止，已发现至少有20多个位点的突变可致ADCC的发生，其中有17个基因已被完全克隆。在所有已确定突变基冈的家系中，有1／2以上是晶状体蛋白基因发生突变，约有1／4是缝隙连接蛋白基因突变，其余包括MIP26、B耶P2、F儿以及转录调节因子基因MAF、PITX3、HSF4、PAX6等㈨]。晶状体蛋白占晶状体中蛋白质的90％，晶状体透明性的高低及折光性能发挥的好坏依赖于晶状体
蛋白的高溶解性和高稳定性。晶状体蛋白基因突变后不仅能造成晶状体蛋白结构的异常而影响其紧密
排列，还会降低晶状体蛋白的溶解性而导致混浊的形成。晶状体蛋白包括仅一、B．和^y．晶状体蛋白3种。

晶状体蛋白基因CRYAA、CRYAB、CR阳Bl、CRYBB2、CRYBAl／A3、CRYGC、伽yGD、CRYGS均会发生ADCC，且多数与CRYGD的突变有关旧曲1。晶状体是无血管组织，由处于终末分化阶段的晶状体纤维细胞组成，完全由晶状体上皮细胞维持其代谢和离子交换平衡。因此，晶状体细胞表面的膜蛋白对于保证细胞问信号分子的正常传递、维持晶状体透明起重要作用。现已证实，膜蛋白基冈GJA3、GJA8和MIP26均与ADCC的发生有关174J。另一种内源件膜蛋白MPl9基因突变导致ADCC仅在动物模型中观察到，而在人类尚未见报道。本研究亦进行了MPl9基因的连锁分析(D19S879标记)，但未见连锁信息。本研究在发现1个ADCC大家系的基础上，首先应用DNA测序的方法排除了已报道的中国家系致病基因突变位点(9个基因的16个突变位点)，提示该家系与其他报道过的中国家系无共同的患病祖先，值得进一步研究。进而，根据已报道的17个
ADCC候选基凶和13个染色体区域，选取物理距离与上述位点紧密连锁的27个微卫星分子标记，进行
连锁分析，结果未发现连锁信息。提示该ADCC家系致病基冈不在国际上已报道的17个ADCC候选基闪和13个染色体区域，该家系中可能存在一个新的ADCC致病基冈。ADCC具有明显的遗传异质性，即相同表型的
白内障可由不同基冈的突变所导致，而同一基因的不同突变或相同突变也会造成不同类型的白内障发
生。本研究进一步证实了ADCC具有高度异质性，缩小了该家系致病基l夭l的寻找范围。在本研究基础
上，今后拟对该ADCC家系进行进一步的全基凶组扫描，并应用定位候选克隆策略，进行ADCC致病基因的定位和克隆，可能会发现新的白内障致病基因。(致谢：感谢所有患者和家属对本研究的配合”

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