2．荧光显微镜检查

　　目前常用的有钙荧光白 (CFW)染色法和吖啶橙染色法。吖啶橙燃料能与真菌DNA结合，在黑背景下显示橙绿色真菌。CFW能与真菌胞壁的几丁质和纤维素紧密结合，使菌丝发出明亮的淡兰色荧光，在荧光显微镜下真菌轮廓和黑暗背景对比明显，易于分辨。CFW还能检测活体标本，适于术中真菌的快速诊断[23]。本法与普通光镜相比，最突出的特点是敏感性高，但工具要求较高，试剂不易购买等缺点使它的广泛应用受到限制。

　　（二）真菌培养[2]

　　临床上对角膜刮片都应进行常规培养，大多数角膜感染的真菌至少3天才能生长，培养1周以上才能确定是否为真菌感染。为了分离鉴定真菌，有时需要辅助培养基。角膜刮片或组织培养是诊断真菌感染的最可靠依据，同时可鉴定真菌菌种，进行药敏实验，为临床上选择敏感药物治疗提供依据。此法的缺点是耗时长，明确诊断时往往影响治疗，且培养结果受取样的影响较大。

　　（三）角膜活检[24]

　　通常在临床上，对疑为角膜真菌感染患者，在角膜刮片和真菌培养阴性，或深层浸润难以用角膜刮片获取标本者；对已确认单疱病毒性角膜炎，在用抗病毒药物联合皮质类固醇治疗期间病情恶化者，行角膜活检极为有用。取得的标本进行镜检、培养可对角膜真菌感染做到快速、正确的诊断，比单纯角膜刮片更为优越。但是，当角膜溃疡大、深者，容易造成角膜穿孔。

　　（四）凝集素组织化学染色

　　凝集素属于蛋白或糖蛋白，能与其特异性糖基相结合，用来探察真菌细胞壁上的糖基受体，从而检测真菌的有无及鉴别其种属。凝集素还能与荧光素、生物素、酶、胶体金等示踪物结合，在光镜或电镜水平显示其结合部位。Thomas等[22]发现不同荧光标记凝集素可以与不同真菌细胞壁的几丁质结合，发出特异荧光，以鉴别菌种；Garcia等[25]认为过氧化物酶标记的植物凝集素在诊断实验性角膜真菌感染，具有较高的特异性和敏感性，是一种可靠的诊断方法。

　　（五）共焦显微镜检查

　　共焦显微镜检查是一种快速、有效、无创性的活体检查手段，能从四维水平进行扫描成像，动态观察角膜组织中的菌丝。谢立信等[26]进行了大宗病历的临床共焦显微镜技术检查，发现了它具有其它方法不能比拟的优点：1.对角膜无损伤；2.检查速度快，范围全面；3.阳性率高达96.9%；李绍伟等[27]研究共焦显微镜检查常见真菌性角膜炎的图象特点，认为该法对真菌性角膜炎的鉴别诊断有重要的参考价值。然而，该法仅对浅层菌丝的检测效果较好，当感染波及角膜全层时，对深层的菌丝和组织难以检查出清晰的图象[26]，且对菌种的鉴别尚不成熟，设备的昂贵限制了它的进一步普及。

　　（六）聚合酶链反应(PCR)

　　近年来，敏感、快速等特点使得PCR技术在诊断真菌性角膜炎中得到越来越广泛的应用。选择真菌基因中不同的目的片段而设计引物，能特异性地检测真菌，如，Alexandrakis等[28]将PCR用于检查镰刀菌引起的兔真菌性角膜炎，敏感性达89%；Kumar等[29]成功将PCR结合单链构象多态性(SSCP)分析应用于临床中烟曲菌角膜炎的诊断。Gaudio等[2]将PCR与培养技术相比较，其中74%的结果一致，10%的病例PCR为阳性，培养阴性，3%的病例PCR为阴性，培养阳性，认为PCR对临床角膜真菌的诊断具有广阔的应用前景。

　　三 小结
　　
　　随着角膜真菌感染发病率的日益增高，早期诊断、早期治疗已成为目前临床的迫切需求。虽然真菌的实验室检测技术日趋成熟，但能应用于诊断临床角膜真菌感染的手段依然有限，各种方法各有利弊。借鉴真菌检测技术的研究成果，寻求更为快速、准确、简便、特异、敏感的技术用于临床角膜真菌的检测及鉴定其种属，将使真菌性角膜炎得到良好的预防和控制。
　　
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