【摘要】目的：探讨p16在睑板腺癌(meibomian gland carcinoma,MGCA)中的表达及其生物学意义。
方法：采用免疫组织化学方法(SP法),检测p16蛋白在65例石蜡包埋的睑板腺癌标本中的表达,并在不同分化程度及生物学行为的睑板腺癌之间进行比较。
结果：睑板腺癌组织与癌旁组织中p16蛋白表达差异有显著性意义 (P<0.05)；睑板腺癌中, p16蛋白表达阳性率随组织学分级降低而降低,不同分化组中p16蛋白表达差异有显著性意义(P<0.01)。不同生物学行为睑板腺癌中p16蛋白表达差异显著，无复发组p16蛋白表达率显著高于复发转移组（P<0.01）。
结论：睑板腺癌中p16蛋白表达异常提示其在睑板腺癌发生发展中起着重要作用。p16蛋白的表达缺失或失活是睑板腺癌发生的重要分子事件，并与睑板腺癌的分化程度、浸润能力及复发转移密切相关，可以为临床判断预后提供依据。
【关键词】 睑板腺癌; p16; 肿瘤分化
0引言
睑板腺癌(meibomian gland carcinoma，MGCA)在国外文献上报道不多，属于恶性程度很高的恶性肿瘤,在国人眼睑恶性肿瘤中,其发病率仅次于基底细胞癌,位居眼睑恶性肿瘤的第2位(约占32.7%)[1]。研究表明,p16/cyclinD1/Rb途径的异常代表着肿瘤发生的一条共同途径，我们采用免疫组化方法对65例睑板腺癌标本中p16蛋白表达进行检测,并复习其病历资料，探讨p16蛋白在睑板腺癌中的表达及与睑板腺癌组织分化及复发转移之间的相互关系。
1 材料和方法
1.1材料 收集华中科技大学同济医学院病理学系及附属同济医院病理科1988/2007年经病理证实的睑板腺癌标本65例。患者年龄最小51～86(平均64.6)岁，男27例,女38例，47例发生于上睑，18例发生于下睑，发生复发及颈部淋巴节转移者14例。标本经甲醛固定,常规石蜡包埋。睑板腺癌患者术前均未经化疗或放疗，并取30例癌旁正常组织作为对照。兔抗人p16多克隆抗体均为Santa Cruz公司产品；SP试剂盒为美国Zymed公司产品,均购自北京中山生物技术有限公司。
1.2方法 除常规病理检查，细针抽吸细胞学检查(FNAC)可见多泡样背景下孤立散在的细胞群，细胞呈环状分布[2]。依据spencer分级标准[3]，本组高分化型24例，中度分化型34例，低分化型7例。将睑板腺癌组织石蜡包埋块作4μm厚连续切片,1张用于选取癌旁正常组织和常规苏木精伊红染色,另3张用于免疫组化染色(SP法),加入一抗前将切片放入pH6.0，0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液内,于微波炉中高温(95℃，10min),进行抗原修复,然后取出,室温下冷却20min,以下步骤按SP试剂盒提供的常规步骤进行DAB显色。阳性对照片由北京中山生物技术公司提供,用与一抗同种动物同稀释度的正常血清及PBS分别代替一抗作空白对照。
统计学处理:运用SPSS 13.0 for windows 软件对数据进行统计分析。
2结果
2.1结果判定标准 p16蛋白多定位于核内,部分可见于胞质内（图1）。以细胞核内出现棕黄色颗粒者为阳性,当细胞质有表达时,其胞核表达的强度必须超过胞质的表达,方可确定为阳性细胞。应用HMIS2000 高清晰度彩色医学图像分析系统，光镜下每张切片随机选取10个高倍视野，阳性细胞数≤10%定为();10%<阳性细胞数≤30%为(+);30%<阳性细胞数<50%为(++);阳性细胞数≥50%为(+++)。
2.2 p16蛋白的表达 29例癌旁正常组织表达p16蛋白，均定位于核内。65例睑板腺癌中，53例表达p16蛋白,经统计分析,正常癌旁组织与睑板腺癌组织p16蛋白表达强度差异有显著性意义 (P<0.05,表1)。
2.3 p16蛋白表达与睑板腺癌复发转移的关系 无复发组p16蛋白阳性表达率明显高于复发转移组且差异有显著性意义(P<0.01,表2)。
2.4 p16蛋白表达与睑板腺癌组织学分型的关系(表3) 本组睑板腺癌中ｐ16蛋白表达阳性率随组织学分级降低而下降，且差异有显著性意义（P<0.01）。
3讨论
细胞周期是细胞生命活动的基本过程，若细胞周期调控异常,细胞将进入病理状态。哺乳动物细胞增殖周期的G1 晚期有一称为“检查点”(checkpoint) 的控制点, 细胞必须通过这一“检查点”才能实现G1S 转换并进入G2M期完成增殖。研究发现,细胞周期G1期的调节因子与癌变关系最为密切，通过使Rb磷酸化或去磷酸化构成以Rb为中心的一个复杂网络。G1“检查点”的调节因子主要涉及p16 蛋白、Rb 蛋白及Cyclin D1,这些调节因子的表达失衡可导致肿瘤的发生[47]。
本实验结果表明:p16在睑板腺癌组织中的表达阳性率低于正常癌旁组织,提示睑板腺癌发生的分子机制涉及p16的表达缺失或失活。65例睑板腺癌组织中,82%(53/65)的病例 p16蛋白表达阳性,19%(12/65)病例 p16蛋白表达阴性，与癌旁正常组织p16蛋白表达差异显著(P<0.05)。本研究中，p16蛋白表达阳性率在无复发组(51例)及复发转移组(14例)分别为94%和及29%，差异有显著性意义(P<0.01)，提示p16可能是判断睑板腺癌生物学行为的重要指标，睑板腺癌发生中p16缺失或失表达可使肿瘤细胞获得更大的生长趋势[8,9]，由此推测p16蛋白表达降低预示肿瘤浸润能力的获得。
本研究同时表明，睑板腺癌组织学遵循p16弱表达的规律,提示p16在细胞周期中异常表达并通过反馈通路的调节作用诱导睑板腺癌的发生。p16蛋白表达阳性率随组织学分级降低而下降,且表达差异十分显著(P<0.01)。p16蛋白缺失者多集中在低分化组中，提示p16表达缺失或失活与睑板腺癌分化不良有关, p16蛋白表达率的降低是睑板腺癌组织分化不良的信号，也提示了睑板腺癌的不良预后。
图1p16蛋白在睑板腺癌中的表达瘤细胞核及胞浆呈棕黄色（sp法，×200）（略）
表1睑板腺癌、正常癌旁组织中ｐ16蛋白的表达（略）
表2睑板腺癌p16蛋白表达与肿瘤复发转移间的关系（略）
表3睑板腺癌p16蛋白表达与其组织学分型的关系（略）
总之，p16蛋白的表达缺失或失活是睑板腺癌发生的重要分子事件，并与睑板腺癌的分化程度、浸润能力及复发转移密切相关，可以为临床判断预后提供依据。
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