作者：孙玲，张铭志
【关键词】 贝伐单抗；角膜新生血管，大鼠；抑制
［Abstract］Objective：To evaluate the inhibition effect of bevacizumab on rat corneal neovascularization model. Method：Silver nitrate sticks were used to cauterize corneas of 16 male SD rats(16 eyes). For the following 14 days, the treatment group(10 eyes)were instilled with bevacizumab 25 μg/mL for six times daily, while the control group(6 eyes)received normal saline for six times daily. After 14 days, the corneal photographs were taken to calculate corneal neovascularization as a percentage of the whole corneal area. Wax sections of corneas were stained with haematoxylin_eosin stain. Results： Mean coverage rate of corneal neovascularization was(197±65)%, (723±113)% in the control group(P<001). Light microscope evaluation was consistent with corneal image analysis. Conclusion： Bevacizumab(25 μg/mL)efficaciously inhibites corneal neovascularization in the male SD rat model.
［Key Words］bevacizumab；corneal neovascularization，rat；inhibition
角膜新生血管可致严重视力损害。研究证明，血管内皮生长因子(VEGF)在角膜新生血管形成过程中起重要作用。贝伐单抗是一种新型的抗VEGF人源化单克隆抗体，在眼科已大量用于年龄相关性黄斑变性及糖尿病视网膜病变的研究并取得明显疗效［1，2］。本实验主要探讨贝伐单抗对大鼠角膜新生血管的抑制作用。
1材料与方法
11模型制备及分组健康雄性SD大鼠(香港中文大学实验动物中心提供)16只，体质量180～200?g。腹腔注射氯胺酮(125?mg/kg)+甲苯噻嗪(10?mg/kg)麻醉后，眼表爱尔凯因(1滴)局部麻醉。以AgNO3烧灼法制备角膜新生血管模型。每只大鼠选取右眼角膜，用棉棒蘸取体积分数75%的AgNO3和体积分数25% KNO3混合液敷角膜10?s后以5?mL NS冲洗残余液体，棉棒拭干。烧灼第2?d，大鼠随机分为实验组［n=10，贝伐单抗(25?μg/mL)点眼］和对照组(n=6，NS点眼)，每组给药6次/d，共14?d。
12角膜新生血管计数
14 过量苯巴比妥钠处死大鼠，摘出眼球，PBS冲洗2次，生物显微镜下观察角膜新生血管，并角膜照相。以NIH图像分析软件(National Instituteof Mental Health，USA)分析角膜相片，计数角膜新生血管。软件中角膜新生血管面积以象素计数，该面积与全角膜面积的比值即为角膜新生血管覆盖率。
13组织切片及形态学观察
大鼠眼球照相后立即放入体积分数10%的福尔马林溶液固定过夜，PBS冲洗3次，脱水、包埋，制备5?μm厚石蜡切片，苏木精_伊红染色，光镜下观察角膜组织病理学改变(角膜血管，淋巴细胞数量，内皮水肿程度以及内皮完整性等)。
14统计学处理
所有数据以±s表示，数据分析用Mann_Whitney U检验。
2结果
2114?d后，实验组角膜新生血管计数明显少于对照组，但角膜缘仍可见新生血管(图1、2，封2)。角膜照相经图像软件分析得：实验组角膜新生血管覆盖率平均值为(197±65)%，对照组(723±113)%(P<001)。
22大鼠眼球组织石蜡切片，苏木精_伊红染色，光镜下实验组角膜内皮完整，基质无明显水肿，血管及淋巴细胞数量明显少于对照组(图3、4，封2)。
3讨论
目前，临床上用于角膜新生血管的治疗方法很多，最常用的光动力学治疗可使新生血管暂时关闭，但复发率很高［3］。药物治疗中，最常用的皮质激素类虽可有效抑制角膜血管增生，但对已形成的角膜血管无明显作用［4］，且长时间使用皮质类固醇药可致严重并发症(青光眼等)。近年来的研究开始探讨血管生长抑制剂治疗角膜新生血管的可能性，但目前尚处于动物实验阶段，且未发现特效角膜新生血管抑制剂。
本实验用贝伐单抗点眼观察其对大鼠角膜新生血管的抑制作用，结果显示，贝伐单抗可明显减少角膜新生血管生成(P<001)。但大鼠角膜缘仍可见部分新生血管，可能原因?①贝伐单抗的浓度不足，其为眼底病临床试验应用浓度的1/1?000；而本实验是点眼给药，其吸收率低于玻璃体腔注射；②除VEGF外，仍有其他细胞因子(可能会降低贝伐单抗对新生血管的抑制作用［5， 6］)可诱导角膜新生血管形成。研究表明，贝伐单抗点眼对眼后段无损害，本实验中，眼球组织切片形态学研究也发现贝伐单抗对角膜无明显损害。
综上所述，本实验结果显示贝伐单抗可明显抑制角膜新生血管生成且对角膜无明显损害，证明贝伐单抗有可能成为一个新的特异性角膜新生血管治疗方法。
【参考文献】
［1］Michels S, Rosenfeld PJ, Puliafito CA, et al. Systemic bevacizumab(Avastin)therapy for neovascular age_related macular degeneration: twelve week results of an uncontrolled open_label clinical study［J］. Ophthalmology, 2005, 112: 1 035-1 047.
［2］Avery RL. Regression of retinal and iris neovascularization after intravitreal bevacizumab(Avastin)treatment［J］. Retina, 2006, 26: 352-354.
［3］Primbs GB, Casey R, Wamser K, et al. Photodynamic therapy for corneal neovascularization［J］. Ophthalmic Surg Lasers, 1998, 29: 832-838.
［4］Ebrahem Q, Minamoto A, Hoppe G, et al. Triamcinolone acetonide inhibits IL_6 and VEGF_induced angiogenesis downstream of the IL_6 and VEGF receptors［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006, 47(11): 4 935-4 941.
［5］Chang JH, Gabison EE, Kato T, et al. Corneal neovascula_rization［J］. Curr Opin Ophthalmol, 2001, 12: 242-249.
［6］Cursiefen C, Rummelt C, Kuchle M. Immunohistochemical localization of vascular endothelial growth factor, transforming growth factor α, and transforming growth factor b1 in human corneas with neovascularisation［J］. Cornea, 2000, 19: 526-533. |
