作者：唐淼，胡楠

    【关键词】  角膜；Langerhans细胞；激光共焦显微镜

    海德堡视网膜断层扫描系统Ⅱ代（HRTⅡ）是利用共聚焦激光的原理获取和定量分析眼后节三维形态的仪器，通过增加Rostock角膜模块组（RCM），HRTⅡ可以转变成共焦激光角膜显微镜，用来获取和分析角膜各层面二维图像和整个角膜的三维图像。我们应用HRTⅡ代/RCM检查了92个正常人角膜，为进一步研究各种角膜疾病提供参考，现报告如下。

    1   对象和方法

    1.1   研究对象   46例受检者（92眼）来自2006年10月~2007年2月在南通大学附属医院眼科接受屈光手术术前检查及常规体检者，其中男20例，女26例，年龄20~61岁，平均38.3±10.9岁。所有受检眼均无外伤、感染及配戴接触镜史，经裂隙灯显微镜检查角膜透明，检眼镜检查无异常。作为正常健康眼入选本研究。

    1.2   激光共焦显微镜检查   表面麻醉后滴50 ul Vidisic眼凝胶(美国博士伦公司生产)于物镜头表面，盖上一次性无菌角膜接触帽；移动固视灯令其向下看，在CCD摄取的监控图像的指导下，调整物镜位置直至激光光束位于上方角膜缘中央；前移物镜至接触帽与之轻微接触，预设置两者接触的焦平面深度为0 μm；转动焦平面调节环以获得角膜不同深度不同层次的图像；根据所获图像的真实焦平面位置(深度用μm数表示)进行调整；移动固视灯改变被检者注视方向，检查上方角膜缘，中央角膜及结膜细胞；选择有价值的图像与录像存盘。

    1.3   图像分析与统计参数   利用HRTII/RCM软件分析系统，计算角膜各层细胞的平均密度。其中将角膜上皮分为3层：表层上皮细胞层、翼状上皮细胞层（角膜基底上皮细胞层之前30 μm处）和基底上皮细胞层，分别计算中央角膜及上下方角膜缘表层上皮细胞层，中央角膜翼状上皮细胞层，基底上皮细胞层的细胞平均密度；将角膜基质层分为两段，计算前基质层（近Bowman膜基质层），后基质层（近Descemet膜最后一层基质层）扫描图像的细胞密度；分析角膜上皮基底细胞层下的神经，1幅图像内所有神经纤维分支的总数量为神经数量(支／幅)；计算上下方角膜缘Langerhans细胞及中央角膜内皮细胞的平均密度；角膜厚度是指角膜接触帽到内皮细胞之间的距离（μm）。

    1.4   统计学方法   用Rostock操作软件进行细胞计数，数据统计用x±s表示，每两组细胞平均密度数值之间统计学差异应用配对t检验，以P<0.05作为差异有统计学意义。

    2   结      果

    共焦显微镜检查的92眼中，获得角膜中央上皮表层细胞图像20眼（21.7％），获得角膜缘表层上皮细胞图像29眼（31.5％），获得角膜缘Langerhans细胞图像59眼（64.1％），获得角膜中央Langerhans细胞图像28眼（30.4％），获得角膜上皮翼状细胞层、基底细胞层、前基质层和后基质层图像92眼(1O0.0％)，获得内皮图像90眼(97.8％)， 对所有图像进行形态学和细胞密度分析如下。

    2.1   上皮层   正常的表层上皮细胞（图1）排列疏松，边界清晰，呈多角形，以六边形为主，胞核明亮。角膜中央表层上皮细胞平均密度为1124±290个/ mm2，上下方角膜缘表层上皮细胞平均密度分别为847±302个/mm2和803±293个/ mm2。上下方角膜缘表层上皮细胞密度相比较差异无统计学意义（t=0.98，P>0.05)，但低于中央表层上皮细胞（t=12.61，P<0.05）。翼状细胞（图2）呈多角形，细胞向侧面延伸变细，形似翼状，边界清晰，胞核反光较弱。角膜中央翼状细胞层细胞平均密度为4279±270个/ mm2。基底细胞（图3）近似圆形，排列紧密，边界明亮，胞质和胞核反光弱。角膜中央基底细胞平均密度为6513±422个/ mm2。

    2.2   角膜缘Vogt栅栏状结构和Langerhans细胞   用共焦显微镜可观察到角膜缘Vogt栅栏状结构（图4）：角膜缘上皮细胞层数增多向深层增生形成上皮柱，上皮柱之间的结缔组织向上突起形成指状突起，上皮柱和指状突起有规律地交替排列。动态观察到血细胞在血管内的流动。Langerhans细胞（Lcs）（图5）位于角膜35~60 μm处，绝大多数Lcs位于基底上皮细胞层和前弹力层，少量Lcs位于翼状上皮细胞层深部。其形态表现为细胞核较大且树枝状突起较多或者核较小且突起较少，可能分别代表Lcs处于成熟和未成熟状态[1]。上方和下方角膜缘Lcs平均密度分别为184±25个/ mm2，175±23个/ mm2。两者比较差异无统计学意义(t=1.15，P>0.05)。Lcs平均密度角膜缘明显高于角膜中央，角膜中央Lcs不可计数。

    2.3   中央角膜上皮基底层下神经纤维   Bowman膜在共焦显微镜下无形态及结构。正常人角膜上皮基底细胞下层神经（图6）排列比较规则，平行走行，浅层神经纤维弯曲度较大，神经纤维分支较多，深层神经纤维粗大，弯曲度小，少见分支，纤维之间的交联很少，神经串珠清晰可见。中央角膜上皮基底层下神经纤维的数量为8.4±1.4支/幅。观察视野为380 μm×380 μm。神经纤维丛旁边偶见明亮的Langerhans细胞，细胞密度不可计数，形态不规则。

    2.4   基质层   在图像的暗背景下被衬托出发亮的细胞核，核间有不定形的黑色背景分割。细胞核形态为成骨细胞状、纺锤状及椭圆形，窥不清细胞胞浆、细胞边缘及板层胶原。基质细胞的密度以Bowman膜下的最高。角膜中央前基质细胞（图7）平均密度为1130±96个/ mm2，后基质细胞（图8）平均密度为778±53个/mm2。两者之间细胞密度差异有统计学意义（t=10.89, P<0.05）。另外，在前中基质层可见粗大的分支状的神经干。

    2.5   内皮细胞层及角膜厚度   角膜内皮细胞(图9)呈六边形，细胞边界呈黑色，胞体明亮，看不到胞核。与角膜内皮镜检查时的细胞形态相同，细胞密度越大者，六边形形态规则占的比例越大；反之，细胞六边形越少，不规则形细胞比例增大。角膜中央内皮细胞平均密度为3128±324个/ mm2。角膜中央厚度为551±39 μm。

    3   讨      论

    通过增加Rostock 角膜模块组件，HRTⅡ可转变成共焦激光角膜显微镜，用来获取和分析角膜各层面二维图像和整个角膜的三维图像。通过HRTⅡ/RCM，我们观察了角膜各层细胞形态并动态观察到角膜缘血管网内血细胞的流动及角膜缘Vogt栅栏状结构。即角膜缘上皮细胞层数增多向深层增生形成上皮柱，上皮柱之间的结缔组织向上突起形成指状突起，上皮柱和指状突起有规律地交替排列，在角膜缘表面呈现出放射状皱纹的特征性结构。角膜的表层上皮在组织学上为复层扁平上皮，在共焦显微镜下表现为大胞体，胞浆丰富，细胞核大而明显，细胞边界清楚，但形态不规则，形态越扁平，面积越大，则是最表层的上皮。当细胞面积达到一定程度，细胞膜破裂，上皮则出现脱落，为角膜上皮的不断更替过程，当有的区域已脱落，周边的细胞未及时覆盖，或下方的基底细胞末及时修补，则表现为图像上的黑区[2]。上方与下方角膜缘表层上皮细胞平均密度差异无统计学意义，二者均少于角膜中央表层上皮细胞。翼状细胞是界于表层上皮和基底上皮之间的过渡细胞，图像上仅偶尔发现，这可能与细胞数量较少或形态不典型有关。上皮基底细胞因细胞密度大，以及有很明显发亮的细胞边界，所以图像上很容易被识别。

    在角膜缘上皮下Langerhans细胞清晰可见，胞体明亮，细胞形态不规则，呈树枝状，上方和下方角膜缘Langerhans细胞平均密度两者比较差异无统计学意义，而在角膜中央区仅偶见Langerhans细胞。Langerhans cell是位于表皮和胃肠道上皮的未成熟树突状细胞（DC），其形态较扁平，表皮中活化的LC很少，LC经刺激而活化后，异体刺激能力增强；隐蔽的突起展开且数量和长度增加； LC具有较强吞噬能力和抗原提呈能力[3]。我们使用共焦显微镜活体观察到Langerhans细胞的形态，并对其细胞密度进行计数。这对于角膜及角膜缘疾病的基础研究有着重要的意义。

    角膜感觉神经丰富，神经末梢来自三叉神经第一主支眼支，经睫状神经到达角膜。大约有60~80支有髓神经于角膜厚度的中1/3处从角膜缘进入角膜，所以在角膜缘处的神经纤维显得粗些，以后逐渐变细，神经纤维继续前行，向浅表前行达Bowman膜，在其下形成致密的神经丛，这与共焦显微镜所观察到的相吻合：正常人角膜上皮基底细胞下层神经排列比较规则，平行走行，浅层神经纤维弯曲度较大，神经纤维分支较多，深层神经纤维粗大，弯曲度小，少见分支。角膜神经纤维丛的检查对探索许多眼病和神经病变有重要意义。王伟等[4]通过共焦显微镜可以观察到糖尿病引起的角膜神经营养性上皮病变，2型糖尿病患者角膜上皮下神经丛神经分支密度减少。张梅等[5]通过共焦显微镜发现水液缺乏性干眼患者角膜上皮基底层下神经存在异常改变。

    本研究同时发现前基质比后基质细胞密度明显增高，这种分布形式可能是人高度进化的结果，与人角膜抵抗各种致病因素造成损伤有关[6]。另外内皮细胞共焦显微镜检查的表现无论是在形态上还是在数量上和角膜内皮镜的检查结果基本一致。

    综上所述，HRTⅡ代/RCM激光共焦显微镜与传统的光学显微镜和电镜检查相比，不但具有高放大倍数及高分辨率等优点，且能在实时、活体条件下对角膜组织（包括角膜缘）进行无损伤的光学断层扫描成像，无需组织切片、固定和染色就能观察到角膜各层细胞、神经及胶原等形态结构，并可研究其动态变化，同时因减少了标本处理过程所造成的假象，真正体现了自然状态下的角膜病变。HRTⅡ代/RCM激光共焦显微镜因其分辨率高，即使在角膜水肿或混浊情况下仍可对角膜深部组织进行检查，这是角膜内皮镜检查所不能达到的。HRTⅡ代/RCM激光共焦显微镜的无创，实时，活体等优点[7]，使其具有广阔的基础研究和临床应用前景。

    【参考文献】

    [1] Zhivov A，Stave J，Vollmar B，et al． In vivo confocal microscopic evaluation of Langerhans cell density and distribution in the normal human corneal epithelium[J]． Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol，2005,243(10): 1056-1061.

    [2] 谢立信，史伟云，郭 萍．正常人活体角膜组织结构的共焦显微镜观察[J]． 中华眼科杂志，2000，36(3)：235-237.

    [3] 龚非力. 医学免疫学[M]. 第2版．北京：科学出版社，2004：169-170.

    [4] 王 伟,李筱荣,袁佳琴． Ⅱ型糖尿病患者角膜细胞形态学特征的共焦显微镜观察[J]．中国实用眼科杂志，2006，24(5)：508-512.

    [5] 张 梅,刘祖国,罗丽辉． Sjogren综合征和非Sjogren水液缺乏性干眼患者角膜上皮基底层下神经的异常改变[J]． 中华眼科杂志,2005,41(10)：936-939.

    [6] 罗丽辉,刘祖国,陈家祺． 正常角膜基质细胞密度和角膜厚度的研究[J]． 眼科研究，2004，22(5)：512-515.

    [7] 荣 蓓,晏晓明． 激光共焦显微镜对正常人眼角膜缘和中央角膜的观察[J]． 中华眼科杂志,2006，42(1)：17-21.