作者：周旌 李明东 林琪玲 李映红 陈茵

    【关键词】  抗毒复明滴眼液；单纯疱疹性角膜炎；实验药效学

    An  Experimental  Study  on  Herpes  Simplex  Kerafitis  Vith  Kangdufuming  Eye  Drops

    〔Abstract〕 Objective  To  observe  the  therapeutic  effects  of  Kangdufuming  eye  drops  on  experimental  HSK.    Methods     The  infected  rabbits  with  HSK  were  divided  random  into  the  treated  group  with  Kangdufuming eye  drops,  control  group  treated  with  acyclovir  eye  drops  and  solvent  group.  The  pathologic  changes  of  the  cornea  were  observed  and  compared  between  3  groups.    Results     The  cornea  ulcer  areas  of  the  treatment  group  were  smaller  than  solvent  group  (P  <  0.05).    Conclusion     Kangdufuming  eye  drops  could  be  markedly effect  in  treatment  of  experimental  rabbit  with  HSK.

    〔Key  Words〕    Kangdufuming  eye  drops;  Herpes  simplex  keratitis;  Experimental  effectiveness

    单纯疱疹性角膜炎（herpetic stromal keratitis, HSK）是一种常见的严重致盲性眼病，占角膜病致盲的首位[1-3]。该病由单纯疱疹病毒（HSV）感染所引起，可导致角膜溶解、新生血管形成及溃疡穿孔等严重病理改变[2]，是当今世界上危害最严重的感染性眼病之一， 占角膜病致盲的 63.2%，近年来由于抗生素、皮质类固醇及其他免疫抑制剂的广泛应用，其发病率有逐年上升趋势[3-5]。由于 HSK 病情顽固，易于复发，严重影响视功能，已成为眼科临床的棘手问题，因而受到学者们的重视和关注。本研究观察了本病治疗中药科研制剂抗毒复明滴眼液对 HSV-1SM44 毒株感染诱导的单疱病毒性角膜炎病理模型的干预效果。

    1    材料与方法

    1.1    实验动物

    选用鼠龄为 4~6 周 Balb/c 小鼠 30 只（中山大学实验动物中心提供），体重 16~18 g，清洁级，雌雄各半。

    1.2    药物

    ①抗毒复明滴眼液为自制科研制剂：取大青叶、贯众、虎仗、决明子等经生药鉴定后，清水洗净，再用纯净水洗 2 次，然后用纯净水浸泡 30 min，煎煮 2 次，收集馏液；合并 2 次煎煮液过滤，馏液加入滤液，过滤，分装于 8 mL 的眼药瓶中，相当于生药材 1.83 g/mL。100℃灭菌 30 min，置 4℃储存备用。②0.1% 无环鸟苷滴眼液由湖北黔江制药厂生产。

    1.3    HSK 模型建立

    1.3.1    病毒和细胞    病毒 HSV-1SM44 毒株（武汉大学医学院病毒研究所提供），使用前滴度为 20×109 pfu·L-1。生产和检测病毒的细胞为非洲绿猴肾细胞（VERO）。培养 VERO 细胞的营养液为含 5% 胎牛血清、青霉素（100×103 U·L-1）、链霉素（0.1 g·L-1）的 DMEM。

    1.3.2    角膜接种病毒的方法    将小鼠用 1% 地卡因表面麻醉后置于显微镜下，用 1 号无菌针头交叉划伤双眼角膜上皮层呈“#”字形，将 5   L 含有 100× 103 pfu 病毒的 DMEM 滴于角膜表面，同时轻轻按摩小鼠眼睑 10 s。

    1.4    判断病变程度

    按文献标准[4]，稍加改动，作病变程度判断标准：0 级：无着色和混浊；1 级：着色和混浊的范围为原病变（压痕）范围 1/4 以内；2 级：着色和混浊的范围为原病变（压痕）范围 1/4~1/2；3 级：着色和混浊的范围为原病变（压痕）范围 1/2~3/4；4 级：着色和混浊的范围为原病变（压痕）范围 3/4 以上或无变化。

    1.5    实验分组处理

    将造模后的动物按病情轻重分层随机分成 3 组，每组 10 只：第 1 组用注射用水滴眼（对照组）；第 2 组用无环鸟苷滴眼液滴眼（无环鸟苷组）；第 3 组用抗毒复明滴眼液。均每天 5 次（间隔 2 h）滴眼，每次 1 滴，连续 15 d。

    各组分别于 0、3、7、11、15 d 分别由专人进行小鼠角膜 2% 荧光素钠染色，裂隙灯显微镜记录角膜病变范围。

    1.6    统计学分析

    使用 SPSS 13.0 统计软件，计量资料进行方差分析和 q 检验，计数资料用 Ridit 分析。

    2    研究结果

    2.1    用药前各组角膜病变范围比较

    差异无显著性（    检验 P > 0.05），具有可比性，见表 1。

    2.2    各组小鼠角膜病变动态观察比较

    结果见表 2。由表 2 可以看出溶剂对照组接种后第 3 天，角膜出现点状、树枝状病灶，然后不断扩大；第 7~9 天后出现密集的树枝状和地图状溃疡，基质层水肿、浸润。第 11~13 天病变向深层发展，上皮溃疡逐渐缩小，个别自愈。抗毒复明滴眼液治疗组接种后第 3 天，角膜可见点状、树枝状病变，范围较局限；5~7 d 时病情较重，角膜出现基质水肿、浸润。但与溶剂对照组角膜病变范围比较差异有显著性（P  < 0.01）；到 13 d 大部分小鼠角膜病变已痊愈，表明抗毒复明滴眼液有明显抑制或减轻实验性单纯疱疹性角膜炎病变的疗效。无环鸟苷对照组抑制角膜上皮病变的疗效与抗毒复明滴眼液治疗组近似，在平均治疗 7 d 后角膜病变减轻，两组治疗有效时间相比差异无显著性（P > 0.05）。

    3    讨    论

    HSK 是由单纯疱疹病毒（HSV）感染所致，其主要临床表现为点状角膜炎，病情静止期，病毒沿神经末梢轴索上行，以亚病毒形式潜伏于三叉神经节细胞内，在各种诱因的刺激下，病毒再度活化而引起复发感染，临床上分别表现为点状、树枝状、地图状、盘状[1-5]。治疗通常用无环鸟苷，局部或全身应用免疫增强剂、干扰素、胸腺肽等。效果尚欠佳，且易复发。无环鸟苷可以竞争性地抑制 HSV-I，对浅层性 HSK 和深层型 HSK 均有效，国内外眼科科界认为它是一种较安全、首选的治疗 HSK 的药物[5，7，8]。但无环鸟苷目前尚存在一些缺陷：口服只有 15%~30% 生物利用度；局部应用可引起滤泡性结膜炎、浅点状角膜炎、假树枝状角膜炎等等，还偶见有引起急性肾功能衰竭和神经毒性报道；对无环鸟苷耐药的毒株出现增多，对此目前也只能加强耐药性的监测，还没有针对的办法[9-11]。

    单纯疱疹病毒性角膜炎属中医眼科黑睛生翳范畴，临床表现类似于“聚星障”[6]。近年来，中西医结合防治 HSK 已经积累不少宝贵的经验，在辨证、选方、制剂以及对 HSK 复发的认识和治疗上，有了长足的发展。但分析现状，亦存在不足，如选方繁多，用药不一，“各承家技”；中药滴眼液生产、推广有待加强；中药抗复发机制有待进一步研究等[6，12，13]。

    中医认为黑晴直接与外界接触，易感六淫之邪。其中以风热多见[12]。《证治准绳·杂病·七窍门》曰： “翳膜者，风热重则有之。”《原机启微·风热不制之病》：“因热而召，是为外来；久热不散，感而自生，是为内发。”内外致病因素所致黑晴病变是相似的。五轮学说认为黑晴属风轮，内应肝胆，所以本病的发生与肝胆功能失常有关。所以，黑晴易受风热邪毒乘袭，内应与肝，常为肝火上炎所累。因此，其治疗应以疏风解毒、清肝明目为基本大法。抗毒复明方就是我们根据中西医对本病病理生理的认识，基于疏风解毒、清肝明目的原则，结合临床用药经验，筛选而成的治疗本病的中药复方制剂。无环鸟苷是一种有较高选择性的抗HSV-1 的药物，能阻断 HSV-1 的 DNA 合成及抑制HSV-1 复制，大量临床试验证明其疗效确切。本实验研究结果，抗毒复明方具有显著的抗 HSV-1 作用，对实验性单纯疱疹性角膜炎有明显的疗效，但对其具体作用机理还有待于进一步研究。本研究同时表明：对 HSK 的治疗，中医药确有独到之处，中西医结合取长补短、优势互补，有利于发挥中医药特色，进一步提高 HSK 的临床疗效。

    【参考文献】

    〔1〕 Heiligenhaus A, Bauer D, Meller D. Improvement of HSV-1 necrotizing keratitis with amniotic membrane transplantation〔J〕. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001, 42(9): 1969-1974

    〔2〕 Balzarini J, Haller-Meier F, De Clercq E, et al. Antiviral activity of cyclosaligenyl prodrugs of acyclovir，carbovir and abacavir〔J〕. AntivirChem Chemother, 2001, 12(5): 301-306

    〔3〕 Dua HS, Gomes JAP, King AJ. The amniotic membrane in ophthalmology〔J〕. Surv Ophthalmol, 2004, 49:51-77

    〔4〕 杨燕宁, Dirk Bauer, 李海平, 等. 小鼠单纯疱疹性角膜炎中基质金属蛋白酶的表达及活性研究〔J〕. 中华眼科杂志, 2004, 40(6):395

    〔5〕 钟良玉, 来坚, 王晓萌, 等. 单纯疱疹性角膜炎发病机制的现代研究〔J〕. 中国中医眼科杂志, 2003, 13(2):116

    〔6〕 叶晓群, 邬梅影. 辨证分型治疗单纯疱疹性角膜炎105例〔J〕. 湖南中医杂志, 2003, 19(5):47

    〔7〕 Suresh PS, Tullo AB. Herpes simplex keratitis〔J〕. Indian Jophthalmol, 1999, 47(3):155-165

    〔8〕 Katagiri N, Kokufuda H, M akino M, et al. A highly efficient synthesis of cyclaradine and its behaviour towards adenosine deaminase〔J〕. Nucleic Acids Symp Ser, 1997, 37:3-4

    〔9〕 Heiligenhaus A, Bauer D. Herpes simplex virus type 1 infection of the corneal〔J〕. De'o Ophthalmol, 1999, 30: 141-166

    〔10〕O'Brien TP, Li QJ, Sauerburger F, et al. The role of matrix metalloproteinases in ulcerative keratolysis associated with perioperative diclofenac use〔J〕. Ophthalmology, 2001, 108:656-659

    〔11〕Yang YN, Bauer D, Wasmuth S, et al. Matrix metalloproteinases (MMP-2 and 9) and tissue inhibitiors of matrix metalloproteinases(TIMP-1 and 2) during the course of experimental necrotizing herpetic keratitis〔J〕. Exp Eye Res, 2003, 77(2):227-237

    〔12〕高培质. 再论单纯疱疹性角膜炎的辨证论治〔J〕. 中国中医眼科杂志, 2003, 13(1):45

    〔13〕高殿文. 双黄连滴眼液治疗单纯疱疹性角膜炎疗效观察〔J〕. 中国中西医结合杂志, 2003, 23(9):711