作者：王晶，石海明

    【关键词】  雷公藤内酯；环孢素A；移植排斥；角膜移植

    Combination therapy of triptolide and cyclosporine A resist xenocorneal transplant rejection

    【Abstract】  Objective  A  xencorneal penetrating keratoplasty model was established in Wistar rat and investigated the effect of anti-rejection by combination therapy under CsA and triptolide. Methods  After the corneal of Guinea-pig was transplanted into the eye of Wistar rat， we injected 100μg/kg body weight of triptolide， 15mg/kg body weight of CsA and 100μg/kg + 10mg/kg of triptolide and CsA for anti-rejection. The observations on the effect of different anti-rejection agents base the method of Holland and immunochemistry. Results   (1)Clinical observation had shown more long-term survival in xenocorneal recipients with combination therapy than triptolide or CsA separating therapy. (2)The changes of percent of CD8+ cell in combination therapy group was less than other therapy groups and percent of IL-2R+ cell in combination therapy group and CsA group was less than triptolide group(P＜0.05).(3)15 days after keratoplasty， there were a few lymphocytes infiltrating the graft cornea in combination therapy group and excel other therapy groups.Conclusion  Tiptolide and CsA have a synergetic effect on preventing and treating transplant rejection.

    【Key words】  triptolide；CsA；transplant rejection；keratoplasty

    历史上，因移植角膜的特惠性生存使眼部被视为具有免疫赦免性的器官之一。最近的研究表明，角膜具有和机体其它器官相似的免疫成分和免疫体系，角膜的免疫赦免是相对的。角膜移植术后，排斥反应的发生率仍为10%～65%，因此和其它组织、器官移植一样，角膜移植排斥是角膜移植术后继发移植失败的最常见的原因，而且有着与前者相似的排斥机制［1］。即：(1)创伤修复和炎症期；(2)移植抗原致敏期；(3)激活免疫活性细胞；(4)移植物（植片）受损期。我们应用大鼠异种穿透性角膜移植的动物模型，研究雷公藤内酯与环孢素A（cyclosporin A，CsA）联合用药抗移植排斥的效果。

    1  材料

    1.1  实验动物  Wistar 大鼠2～3月龄，180～220g，雄性18只，豚鼠（英国种短毛）2～3月龄，200～230g，雄性9只。由第一军医大学动物实验中心提供，清洁级。

    1.2  免疫组化试剂  小鼠抗大鼠T淋巴细胞亚群W/OX系列单克隆抗体MaRTh/i(W3/5)，MaRTc/s(OX-8)，MaR Ia(OX-6)，MaR IL-2R(ART-18），MaR WBC(W 6/32)均由军事医学科学院进口分装。ABC显色试剂盒为Dako公司产品。

    1.3  抗排斥药物  雷公藤内酯注射液为福建省药物研究所提供，CsA注射液为瑞士SANDOZ公司产品。

    2  方法

    2.1  大鼠异种穿透性角膜移植术（右眼）  (1)麻醉：2%戊巴比妥钠按1mg/kg腹腔内注射，0.5%地卡因眼液点术眼，2%普鲁卡因0.2ml球后注射。（2）植片制作：豚鼠处死后，0.8%庆大霉素眼液冲洗结膜囊，沿角膜巩缘剪下角膜，以直径4.5mm环钻从内皮面压切成植片。（3）角膜移植：以直径4mm环钻，钻切角膜大深层，以尖刀挑穿后沿钻切口剪下角膜，将植片放置于植床上，11-0尼龙线间断缝合12针，复方NaCl注射液注入形成前房，四环素眼膏涂眼。

    2.2  雷公藤内酯、CsA注射液的使用  雷公藤内酯按100μg/kg体重; CsA注射液按15mg/kg体重；雷公藤内酯和CsA注射液联合用药，雷公藤内酯仍按100μg/kg体重，CsA注射液按10mg/kg体重给药，上述各组均每日腹腔注射给药1次。

    2.3  临床观察  根据Holland等建立的临床观察评分法［2］，观察得分值为RV(rejection value)，计分标准如下：（1）透明度：0，清亮;1，轻度浑浊；2，浑浊加重，前房清楚可见；3浑浊加重，前房模糊可见；4，全浑浊，前房看不清。（2）水肿： 0，无基质水肿或上皮水肿；1，轻度基质增厚；2，弥漫性基质水肿；3，弥漫性基质水肿合并上皮Microcytic水肿；4，大疱性角膜病变。（3）新生血管： 0，无；1，周边新生血管；2，切口部新生血管；3，植片部新生血管；4，全角膜新生血管。Opton裂隙灯显微镜观察，每隔3天计分一次，动态观察30天。

    2.4  免疫组化观察  （1）角膜移植术后第6天、第10天和第15天各组各取1只鼠角膜移植眼球做冰冻切片及免疫组化，方法：①在冰冻切片机中切片。②切片置于0.03%H2O2甲醇中放入真空箱内，在66.7kPa负压下持续10min。③自来水洗，0.01mol/L pH7.2 PBS洗3次，共3min。④加入正常马血清，同②处理。⑤直接分别加入小鼠抗大鼠T淋巴细胞亚群W/OX系列单克隆抗体MaRTh/i(W3/5)，MaRTc/s(OX-8)，MaR Ia(OX-6)，MaR IL-2R(ART-18），和MaR WBC(W6/32)。⑥PBS洗3次同③。⑦加入生物素化羊抗小鼠二抗（1：600），同③。⑧PBS洗3次，DAB显色，HE复染。（2）外周血淋巴细胞亚群分析：2%戊巴比妥钠麻醉Wistar大鼠，心内穿刺取血1.5ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液离心（1500r/min，15min）分离淋巴细胞，RPMI1640离心洗3次，调整淋巴细胞悬液浓度为1×105个/ml，取0.1ml涂片，吹干，用丙酮固定1min，PBS洗片。同（1）法作免疫组化。动态观察术前3天，术后3天、9天、15天、21天和30天。

    2.5  统计学分析  所有实验数据均用±s表示，用SPSS11.0统计软件作Student-Newman-Keuls test(SNK)分析，两样本均数间进一步作Student’s T-test，分析，P＜0.05为差别有统计学意义。

    3  结果

    3.1  角膜移植术后的临床观察  动态观察各治疗组间RV变化，随着时间的推移治疗组RV曲线上升趋势比对照组要缓慢，而CsA和雷公藤内酯联合用药组RV曲线上升的最为缓慢（图1）。以RV>7时为发生严重排斥反应的标准，观察对照组发生严重排斥反应的时间为(13.1±1.5)天，而各治疗组达到此RV时间明显长于对照组（P＜0.01），差别有统计学意义。CsA(10mg/kg)和雷公藤内酯(100μg/kg)联合用药抗排斥作用要优于同等剂量的单独给药（P＜0.01），见表1。

    图1  大鼠穿透性异种角膜移植临床观察

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