【摘要】目的：观察可溶性Tie2融合蛋白（soluble Tie2 fusion protein, sTieFc）对视网膜血管新生（retinal neovascularization, RNV）的抑制作用，同时分析其对缺血性视网膜病变的影响。
方法：将生后7d的C57BL/6幼鼠置于高氧箱中饲养5d取回至正常空气环境诱导RNV模型，生后12d和14d选取一眼玻璃体腔注入人sTieFc 0.67μg，对侧眼在相同时点注入人IgG作为对照。生后17d处死动物行视网膜铺片和免疫组织化学染色检查，测量视网膜血管无灌注区的面积，计数RNV内皮细胞核数目，定量分析sTieFc 对于缺血性视网膜病变以及实验性RNV形成的影响。
结果：对照组和实验组均成功建立了RNV模型，实验组RNV的形成受到抑制（P<0.05），同时sTieFc也加重了RNV模型的缺血过程（P<0.05）。
结论：sTieFc可以抑制实验性RNV的发展，提示拮抗Tie2可能成为治疗RNV有效的生物学方法之一，其可能加重缺血性视网膜病变的潜在副作用需进一步探讨。
【关键词】 视网膜血管新生；缺血性视网膜病变；Tie2
Suppression of experimental retinal neovascularization utilizing soluble Tie2 fusion protein
Han Zhang, ZheLi Liu
Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Correspondence to: Han Zhang. Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China. [email protected]
AbstractAIM: To investigate the effects of neutralizing Tie2 on retinal neovascularization (RNV) and ischemic retinopathy in the mouse model of oxygeninduced retinopathy (OIR).METHODS: C57BL/6 mice at postnatal day 7 were exposed to 750mL/L oxygen for 5 days and allowed to recover in room air to induce RNV. At the 12th and 14th day, the animals were intravitreally injected with 0.67μg soluble Tie2 fusion protein (sTieFc). Retinal fluorescein angiography and immunohistochemical staining were used to assess the development of ischemic retinopathy and experimental RNV quantitatively at the 17th day, by measuring the area of vascular obliteration and counting the number of preretinal nuclei.RESULTS: sTieFc significantly inhibited the formation of RNV (P<0.05) and aggravated the ischemia (P<0.05) compared with control mice.CONCLUSION: Our findings suggest that Tie2 may be a promising potential target for antiangiogenesis therapy for RNV. Further research is needed to decrease the undesirable effect of inhibiting retinal revascularization.
KEYWORDS: retinal neovascularization; ischemic retinopathy; Tie2
0引言
视网膜新生血管（retinal neovascularization, RNV）常见于糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变以及镰状细胞贫血等多种眼疾，常引起出血和牵引性视网膜脱离导致视力丧失。研究表明，其发生是由于局部血管新生促进因子和血管新生抑制因子间平衡被打破的结果，其中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）及其受体系统被认为是最重要的血管新生促进因子[1]。血管生成素和Tie2（angiopoietinTie2）是最近研究较多的另一组血管内皮细胞特异性配体受体系统，包括4个配体（Ang1，2，3，4）和他们共同的受体Tie2，其中Ang1和Ang2在血管的发生以及包括RNV在内的各种血管新生过程中起着重要作用[26]，提示阻断这一系统的作用可能成为防治血管新生有效的生物学治疗方法。我们通过建立氧诱导RNV模型（oxygeninduced retinopathy, OIR），定量分析可溶性Tie2融合蛋白（soluble Tie2 fusion protein, sTieFc）对RNV形成的抑制作用，同时分析其对缺血性视网膜病变的影响，为DR及其它难治性新生血管性眼病的生物学治疗提供新的线索和依据。
1材料和方法
1.1材料
生后7d健康C57BL/6小鼠（日本SLC公司），sTieFc（日本九州大学石桥达朗教授提供），人IgG（美国Pharmingen公司），生物素标记的Griffonia simplicifolia lectin I（GSA, 美国Vector Laboratories公司），过氧化物酶结合的卵白素（美国Vector Laboratories公司），DAB发色液（美国Invitrogen公司），高分子量FITCdextran溶液(美国Sigma公司)。
1.2方法
1.2.1 OIR模型的建立[7]
将生后7d的幼鼠与哺乳母鼠一起置于密闭的高氧箱中，氧气浓度保持在750mL/L左右，饲养5d后（生后12d）取回至正常空气环境，继续饲养至生后17d处死用于实验。
1.2.2 sTieFc阻断血管生成素的作用
每只幼鼠随机选取一眼归入实验组，在生后12d和14d麻醉后玻璃体腔注入人0.5μL sTieFc 0.67μg；对侧眼归入对照组，在相同时点注入等量的人IgG。
1.2.3视网膜铺片[7]
生后17d将OIR幼鼠麻醉后固定（实验组和对照组各36眼），打开胸腔，将1mL高分子量FITCdextran溶液注入左心室，摘除眼球于40g/L多聚甲醛中固定，在手术显微镜下制作视网膜铺片，用荧光显微镜观察。
1.2.4免疫组织化学染色[8]
生后17d处死OIR幼鼠（实验组和对照组各30眼），摘除眼球制作6μm冰冻切片，以40g/L多聚甲醛固定、3mL/L过氧化氢封闭后用于免疫组织化学染色，标记血管内皮细胞。一次抗体为与血管内皮细胞特异性结合的GSA，二次抗体为过氧化物酶结合的卵白素，DAB 发色后血管内皮细胞被染为深棕色。最后HE复染，置于显微镜下观察。
1.2.5视网膜血管无灌注区面积的测量[9]
在视网膜铺片上测量视网膜中央血管无灌注区的面积，定量分析sTieFc对缺血性视网膜病变的影响。
1.2.6 RNV内皮细胞核计数[7]
采用免疫组化切片计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目，定量分析sTieFc对RNV发展的影响。每间隔9张6μm冰冻切片选取一张计数，每只眼球大约计数14～17张切片，计算每张切片血管内皮细胞核数目。
统计学处理：实验数据以mean±SD表示，采用SPSS 12.0统计软件的t检验进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
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