【摘要】 探讨大麻素(WIN55,2122)点眼治疗是否可以抑制慢性青光眼兔模型玻璃体谷氨酸浓度的增高。
方法：家兔15只随机分为正常对照组，高眼压组和大麻素治疗组每组均5只10眼。除正常对照组以外均予前房注射复方卡波姆制成慢性青光眼模型。成功造模4d后，高眼压组用生理盐水点眼，大麻素治疗组用1.25g/L的大麻素滴眼液点眼。治疗4wk后取材，检测玻璃体谷氨酸浓度。
结果：高眼压组的玻璃体谷氨酸浓度明显高于正常对照组，差异有统计学意义（高眼压组vs正常对照组，P<0.05），大麻素治疗组与正常对照组比较差异无统计学意义（大麻素治疗组vs正常对照组，P>0.05）。
结论：局部应用WIN55，2122可以使慢性青光眼兔模型玻璃体谷氨酸浓度降低。
【关键词】 大麻素 WIN55 2122 青光眼 玻璃体 谷氨酸
0引言
青光眼是一种可以造成严重视功能损害的疾病，其特征性的病理改变是视网膜神经节细胞(RGC)凋亡和视神经纤维丢失。随着对其神经损害机制研究的深入，人们发现，兴奋性神经递质谷氨酸在RGC损伤中起着重要作用。国内外的实验均证明，高眼压可致视网膜谷氨酸上升，过量的谷氨酸对视网膜产生兴奋性毒性，引起RGC死亡[14]。寻求一种可以抑制谷氨酸神经毒性的药物，从而进行青光眼视神经保护治疗，是当今青光眼研究领域的热点。大麻素是包括从大麻植物中提取的,人工合成的以及存在于动物体内的内源性大麻素样物质在内的一类具有生物学活性的物质。有研究表明，它主要是通过存在于人体内的CB1和CB2两种受体介导来发挥作用的，眼部效应主要是CB1受体介导的。WIN55，2122是非选择性大麻素受体激动剂的一种。以往的一些研究表明，大麻素可以抑制局部谷氨酸释放以及拮抗相应的NMDA受体，从而发挥视神经保护作用。但他们多采用全身给药的方法，势必会产生许多长期或短期的不良效应。我们给青光眼兔模型应用大麻素点眼治疗，探讨它是否同样可以抑制局部谷氨酸浓度的增高。
1材料和方法
1.1材料
健康成年家兔15只，无眼疾，雌雄不拘，体质量2.5～3kg，购自山西医科大学实验动物中心；卡波姆一940购自上海申兴制药厂，配制成3g/L的复方卡波姆溶液（含地塞米松0.25g/L）；速眠新注射液Ⅱ由农牧大学军事兽医研究所生产；WIN 55,2122 mesylate，Tocrisolve TM100购自上海优宁维生物科技有限公司，配制成1.25g/L的大麻素滴眼液；Schiotz眼压计购自太原六六视觉科技股份有限公司；高效液相色谱分析仪由山西医科大学药学院提供；高速离心机由山西医科大学中心实验室提供。
1.2方法
家兔15只完全随机分为正常对照组、高眼压组，大麻素治疗组，每组均5只10眼。造模前7d测量基础眼压，除正常对照组以外，均于颞侧角巩膜缘行前房穿刺，抽出房水0.1mL，注入等量复方卡波姆溶液，注射后分时段测量眼压，确定眼压稳定升高（>22mmHg）7d以上为造模成功[5]，期间眼压下降者复注1次。成功造模4d后，高眼压组每天用生理盐水点双眼，早晚各1次,大麻素组每天用1.25g/L的大麻素滴眼液点双眼，早晚各1次。治疗4wk后静脉注射空气处死动物，抽取后极部玻璃体0.1mL，生理盐水稀释至0.5mL，置于1.5mL Eppendorf管中70℃冷冻保存。高效液相色谱分析测定玻璃体谷氨酸的浓度:各玻璃体样本中加入磺基水杨酸钠1mg,混匀后10000r/min离心5min。取上清,自动进样器进样60μL。甲溶液(柠檬酸钠19.6g,酚1.0g,双蒸水定容至1L,硝酸调pH至3.05)和乙溶液(硼酸1.5g,硝酸钠21.0g,双蒸水定容至1L,6mol/L氢氧化钠调pH至9.60) 62℃梯度洗脱30～90min。邻苯二甲醛柱后衍生法荧光检测谷氨酸浓度。
统计学处理:数据以±s的形式表示,统计处理采用SPSS12.0软件分析，多个样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNKq检验。
2结果
高眼压组的玻璃体谷氨酸浓度(6185±809g/L)与正常对照组(873±327g/L)比较差异有统计学意义（P<0.05），说明眼压增高可以使局部的谷氨酸浓度明显增高。大麻素组的玻璃体谷氨酸浓度(1195±161g/L)与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），与高眼压组比较有统计学意义（P<0.05），说明应用大麻素治疗以后，可以有效的降低局部的谷氨酸浓度，减轻RGCs及视神经的损伤。
3讨论
许多研究证实,兴奋性神经递质谷氨酸在RGCs损伤中起着重要作用。谷氨酸是视网膜的主要兴奋性递质，它在神经元内以较高浓度存在，在局部（突触内）短暂释放，正常情况下不引起毒性。但在某些因素作用下，谷氨酸大量释放，细胞外谷氨酸浓度异常升高：1）高眼内压作用于细胞体造成受损细胞细胞膜的通透性增加；2）Müller细胞在高眼压缺血缺氧时受到损害，清除谷氨酸的功能下降；3）死亡细胞崩解溢出大量的谷氨酸［1,6］。从而对视网膜神经节细胞产生毒性作用。Dryer等[1,2]报道,青光眼患者玻璃体中谷氨酸的浓度是白内障患者玻璃体中谷氨酸浓度的2倍；实验性猴青光眼玻璃体中谷氨酸浓度为59.7±1.3μmol/L，视网膜表面是80.3±7.8μmol/L，而正常猴玻璃体和视网膜表面的谷氨酸浓度分别为12.3±1.5μmol/L和12.3±2.3μmol/L。谷氨酸对视网膜的损伤主要是通过激活N甲基D天(门)冬氨酸（NMDA）受体介导的。NMDA受体活化后，大量Ca2+内流引起细胞内Ca2+超载，激活与凋亡有关的酶类，如核酸内切酶、蛋白激酶C、一氧化氮合成酶（NOS）等。NOS催化L精氨酸合成一氧化氮（NO），NO可直接对邻近细胞产生毒性，同时合成毒性复合物ONOO及其他氧自由基，导致神经节细胞损伤和死亡。Lucas等［7］给小鼠sc谷氨酸,发现可以引起视网膜神经节细胞和内核细胞神经元的损伤和死亡。
Vorwerk等［8］在鼠玻璃体腔内每隔5d注射2.5mmol/L的谷氨酸1μL，连续3mo，RGC数为56000±9600，而对照组RGC数为96500±8500。杨新光等[9]的研究发现，眼压缓慢升高可导致兔眼玻璃体谷氨酸浓度升高，对视网膜产生损伤，而静脉注射藏红花提取液可以对这种变化产生拮抗作用。
有研究证实，大麻素的神经保护作用主要是通过激活体内的CB1受体，从而抑制兴奋性毒素—谷氨酸的释放，并阻断NMDA受体等途径而产生的。Straiker等[10]用抗CB1受体的免疫球蛋白发现,人眼的睫状肌上皮、睫状肌、睫状体血管、角膜上皮、小梁网以及Schlemm管均有CB1受体。Straiker等[10]在视网膜感觉神经层的很多区域均发现有CB1受体存在，如内外丛状层与视网膜的突触部、内核层、神经节细胞层及光感受器的外段。Zalish等[11]用鼠视神经挤压伤模型研究HU211对视神经的作用，发现其可减少轴突变性和促进轴突再生。ElRemessy等[12]和Zhuang等[13]的研究发现，Δ9tetrahydroxycannabinol(THC)和WIN55，2122可以阻滞NMDA诱导的神经毒性，且这种作用可以被CB1受体阻滞剂SR141716A部分阻止。Zhuang等[13]用WIN55，2122阻滞NMDA诱导神经细胞内Ca2+的聚集，起到神经保护作用。有资料显示，可能是因为大麻素类均含有酚结构，从而具有潜在抗氧化性质，保护细胞免受谷氨酸介导的细胞死亡和氧化应激反应[14]。Davies等[15]发现，在大鼠纹状体脑片中，WIN55，2122可以抑制皮层纹状体的谷氨酸能突触传递，而CB1受体拮抗剂SR141716可使这种作用消失。Huang等[16]应用膜片钳技术证实，CB1受体的激活还可以抑制纹状体内的谷氨酸释放。从本实验的结果来看，WIN55，2122局部应用以后，可以有效的降低局部的谷氨酸浓度，对此种神经损害产生保护作用。本实验采用的药物浓度较低，故而在药物配制成分中加入了卡波姆作为辅料。卡波姆是丙烯酸与丙烯基蔗糖交联的高分子聚合物,可在水中溶胀,呈酸性,pH值升高,粘度逐渐增大。它具有较稳定的理化性质,不易与所载药物起反应和改变其特性,可以增加药物在眼部的停留时间,减少全身吸收,从而增加局部用药物的生物利用度[17,18]。在今后的研究中，通过增加药物浓度，延长用药时间，采用其他的局部给药途径，从而加大局部的药物浓度，有望产生更好的效果。
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