【摘要】 目的：检测缺氧诱导因子1α（HIF1α）与血管内皮生长因子（VEGF）在糖尿病大鼠视网膜中的表达，探讨其在糖尿病视网膜病变（DR）发生发展中的作用。
方法：SD大鼠120只随机分为对照组与DR组，DR组采用链脲佐菌素(STZ)一次性建立糖尿病模型。应用免疫组化SP法和RTPCR技术分别于1，3，6mo检测视网膜中HIF1α与VEGF蛋白及其mRNA的表达变化。
结果：HIF1α与VEGF蛋白及其mRNA在对照组视网膜中不表达，在DR组中呈进行性表达增强（P<0.05）；DR组中HIF1α与VEGF的表达呈正相关（r=0.605 ,P<0.05）。
结论：DR视网膜中HIF1α与VEGF表达增强，与DR的发生发展密切相关。
【关键词】 糖尿病视网膜病变；缺氧诱导因子1α；血管内皮生长因子
Expression of hypoxiainducible factor1α and vascular endothelial growth factor in the retina of diabetic rats
GuoXing Xu, JianBin Xu, JianZhang Hu
Foundation items: Key Technologies R & D Program of Ministry of Health of Peoples Republic of China (No. WKJ20052013), Natural Science Research Foundation of Fujian Province (No. C0510015); Science Research Foundation of Fujian Provincial Educational Department (No. JB05244)
Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian Institute of Ophthalmology, Fuzhou 350005, Fujian Province, China
Correspondence to: GuoXing Xu. Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian Institute of Ophthalmology, Fuzhou 350005, Fujian Province, China. [email protected]
AbstractAIM: To detect the expression of hypoxiainducible factor1α (HIF1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the retina of diabetic rats, and to investigate their roles in the pathogenesis of diabetic retinopathy (DR).METHODS: One hundred and twenty SD rats were randomly divided into two groups: DR group and control group. Diabetes was induced by streptozotocin (STZ) intraperitoneal injection in DR group. The techniques of immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) were used to examine the expression of HIF1α,VEGF protein and mRNA in retina respectively at 1,3,6 months after STZ injection.RESULTS: The results of immunohistochemical technique and RTPCR showed that the expression of HIF1α, VEGF protein and mRNA in retina were not found in control group, but were found gradually increased in DR group (P<0.05). There was a positive correlation between the expression of HIF1α and that of VEGF(r=0.605，P<0.05). CONCLUSION: HIF1α may regulate the expression of VEGF, and both are involved in the pathogenesis of DR.
KEYWORDS: diabetic retinopathy;hypoxiainducible factor1α; vascular endothelial growth factor
0引言
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常见的慢性微血管并发症，目前发病机制尚未完全阐明。近年来一系列研究表明，缺氧诱导因子1（hypoxiainducible factor1，HIF1）是缺血缺氧诱导细胞产生的核转录因子，能诱导下游血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因的表达[1]；VEGF具有促进血管通透性增加、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，在DR的发病过程中起着重要的作用[2]。我们通过STZ诱导大鼠糖尿病模型，应用免疫组化技术和逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR)检测HIF1α，VEGF蛋白及其mRNA在不同病程视网膜中的表达情况，以期探讨HIF1α与VEGF在DR发病机制中的作用。
1材料和方法
1.1材料
链脲佐菌素(STZ)，Sigma公司；兔抗大鼠HIF1α抗体、兔抗大鼠VEGF抗体，武汉博士德生物公司；SP试剂盒，DAB酶底物显色试剂盒，福州迈新公司；Trizol试剂盒、RT—PCR扩增试剂盒，美国Fermentas公司；PCR反应的HIF1α，VEGF和β肌动蛋白引物序列由美国Invitrogen公司合成，HIF1α引物上游：5TGCATCTCCACCTTCTACCC3，下游：5CTGCTCCATTCCATCCTGTT3，产物长度为385 bp；VEGF：引物上游：5GCCCATGAAGTGGTGAAGTT3，下游：5AATGCTTTCTCCGCTCTGAA3， 产物长度为363bp；内对照β肌动蛋白（βactin）引物上游：5TCTACAATGAGCTGCGTGTGG3，下游：5GGAACCGCTCATTGCCAATG3，产物长度为497bp。生物显微镜Olympus BH2型；微量快速血糖仪器One TouchII型；GeneAmp 9700型PCR扩增仪，紫外分光分析仪（DU800），凝胶成像分析系统（Gel Doc2000），JY3000+型多用途电泳仪。雄性清洁级SpragueDawley (SD)大鼠120只，体质量180～210g，由上海西普尔－必凯实验动物有限公司提供，大鼠随机分为糖尿病组（DR组）和对照组各60只，再分为1mo组(C1)、3mo组(C3)和6mo组(C6)各20只；适应性饲养1wk。将糖尿病组的大鼠禁食12h，一次性ip 20g/L STZ溶液（临用时用0.1mol/L，pH4.5的柠檬酸缓冲液配置），剂量为70mg/kg，3d后，在大鼠尾静脉采血测血糖浓度，凡在16.7mmol/L以下的不能视为糖尿病的大鼠需排除。正常组予以ip 0.1mol/L，pH4.5的柠檬酸缓冲液。血糖浓度每2wk测定1次，尾静脉取血用血糖仪监测血糖。对照组大鼠血糖始终处于正常值范围，DR组大鼠血糖在STZ诱发3d起至实验结束均大于16.7mmol/L。实验过程中，DR组与对照组的血糖比较，差异有统计学意义(P<0.01)；而DR组或对照组的组间不同时间，血糖值差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病诱导后1，3，6mo戊巴比妥钠(60mg/kg)，iv分别处死动物后，立即取出双眼，取左侧眼球于锯齿缘后 0.5mm处剪开眼球壁，去除眼前节和玻璃体，分离视网膜放于40g/L中性甲醛中固定，石蜡包埋，0.4μm连续切片；取右眼球在眼科显微镜下钝器解剖法剥离视网膜，存于液氮速冻后80℃保存，待提取视网膜总RNA。表1DR大鼠视网膜HIF1α和VEGF的表达（略）
1.2方法
1.2.1视网膜中HIF1α和VEGF表达的检测
按SP超敏试剂盒免疫组化染色步骤进行，HIF1α和VEGF一抗的工作浓度皆为1∶100，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，阳性对照片购自公司。染色阳性判定标准：HIF1α和VEGF均以细胞质内有棕黄色细颗粒为阳性，每例标本取4张切片，光镜下每张切片任取5个高倍视野进行细胞计数，至少计数100个细胞，以阳性细胞总数的百分比表示阳性表达程度，如阳性细胞占总细胞数的比值小于5%，则视为标本表达阴性。
1.2.2视网膜中HIF1α和VEGF mRNA表达的检测
Trizol一步法提取视网膜总RNA，每管取出1μL用紫外分光光度计测定其浓度及纯度；取出2μL用20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。取总RNA 2μL，根据试剂盒提供方法以随机引物逆转录合成模板cDNA。βActin的PCR反应参数：94℃预变性5min，扩增94℃30s, 55℃ 45s, 72℃ 50s,32个循环，最终延伸72℃ 7min，HIF1α反应参数：94℃预变性5min，扩增94℃ 30s, 55℃ 45s, 72℃ 45s,30个循环，最终延伸72℃ 7min；PCR产物均在4℃冰箱保存；VEGF的反应参数：94℃预变性5min，扩增94℃ 30s, 55℃ 45s, 72℃ 60s,30个循环，最终延伸72℃ 7min； PCR产物均在4℃冰箱保存。PCR产物以15g/L琼脂糖凝胶电泳，置凝胶于凝胶成像分析系统进行灰度扫描，Quantity One4.4.1自动分析软件对目的基因和βactin的扩增产物条带分别进行光密度值分析。记录HIF1α，VEGF与βactin的吸光度(A)值，分别计算两者比值，进行半定量分析；目的基因的表达指数=目的基因条带的积分A值/相应βactin条带的积分A值。
统计学处理：在SPSS11.5软件上运行，计量资料以均数±标准差（±s）表示，进行t检验、方差分析（两两比较采用SNK法）、直线相关分析，以P<0.05作为差异有统计学意义的标准。
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