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2结果
2.1免疫组化检测结果
HIF1α和VEGF蛋白在对照组视网膜上基本不表达（图1A，2A）；在DR1组，主要在视网膜内核层及外核层细胞的胞核呈弱表达，随着病程的延长，神经节细胞、血管内皮细胞、内界膜等出现表达，并呈进行性增强（图1B,C,D,2B,C,D），各组间的差异有统计学意义（FHIF1α=357.414，P<0.05；FVEGF=289.434,P<0.05；SNK法两两比较各组均P<0.05，表1）。经直线相关分析，DR病变随着病程发展，HIF1α与VEGF之间的表达存在明显的正相关关系（r=0.636, P<0.05）。
2.2 RTPCR检测结果
用紫外分光光度计测抽提的总RNA在260nm和280nm两个波长下的读数（A值）,测定A260nm/A280nm值在1.8～2.0之间，表明抽提总RNA没有蛋白质和其他杂质污染，纯度较高，可以用作逆转录的模板。琼脂糖凝胶电泳鉴定结果可见28S和18S两个清晰条带，28S/18S比值约为2∶1，提示抽提的RNA比较完整，未见明显降解。HIF1α mRNA在对照组基本上不表达，在DR组则表达呈进行性增强，不同时间点的差别均有统计学意义（F=312.224，P<0.05；SNK法两两比较各组均P<0.05）；同样检测VEGF mRNA在对照组不表达或微弱表达，在DR组表达亦呈进行性增强（F=256.112，P<0.05；SNK法两两比较各组均P<0.05，表1，图3A,B）。经直线相关分析，DR病变随着病程发展，HIF1α与VEGF之间的表达存在明显的正相关关系（r=0.605, P<0.05）。
3讨论
3.1视网膜缺氧与DR DR是糖尿病微血管病变在眼底独特环境中的表现，长期慢性的高糖血症是其发病的基础。已知高糖血症能使红细胞内2，3二磷酸甘油酸水平降低，红细胞携氧能力减低；使糖基化血红蛋白在血红蛋白中的比例增高，对氧的亲和力高于正常血红蛋白，使氧不易扩散至组织中；使毛细血管基底膜增厚以及血液成分的改变等，从而引起视网膜组织慢性缺血缺氧。低氧能使机体一系列的基因表达发生变化以适应低氧的环境，如刺激多种促血管生成因子生成及整合素、基质金属蛋白酶等合成，引起细胞外基质与基底膜溶解、消退，进而细胞迁移、增殖，导致视网膜新生血管生成[3]。因此，慢性缺血缺氧导致视网膜机能改变是DR发生、发展的重要环节，寻找这个过程中的靶点因子对于DR的防治具有重要意义。
3.2 DR与HIF1α的表达
HIF1是调节细胞内氧代谢的关键因子之一，也是迄今为止发现的唯一的能在特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子，能对细胞的缺氧起稳定作用[4,5]。它最先由Semenza等[6]于1992年在缺氧诱导的细胞核抽提物中发现，由α亚基和β亚基组成，其中HIF1α是功能性亚基，决定HIF1的活性，它受缺氧诱导，且只有在缺氧状态下才开始表达，并与结构性β亚基结合形成具有活性的HIF1[1,4]。我们发现，正常大鼠的视网膜中不表达HIF1α，而DR组中出现明显的表达，证实了缺氧在DR发病机制中的重要作用，也提示了HIF1α在DR的发生发展过程中可能起一定作用；HIF1α随着病程的发展进行性表达增强，反应视网膜的缺氧随着DR发展而逐渐加重，这也符合DR发展的病理生理过程。
有人认为对HIF1的调节主要发生在转录后或翻译后水平，即在蛋白质水平，缺氧并不增加HIF1αmRNA的表达[7]。然而在本研究中，HIF1α在蛋白质和mRNA水平都表达增强，具有一致性，这可能是DR中对HIF1α的调节机制复杂，HIF1α的激活不仅仅由缺氧引起，其确切的机制需要进一步的研究。活化的HIF1 作为一种起始转录因子，在启动及调控多种缺氧反应基因HRG的转录与表达中起着关键作用[1,4]。本研究中，在蛋白质和mRNA水平上，HIF1α的表达与VEGF都具有明显的正相关性和一致性，这与Ozaki等[8]在缺血性视网膜病变模型中的实验结果是一致的，表明在DR中，VEGF是HIF1α的靶基因之一，调节VEGF的表达可能是HIF1α参与DR发病的重要作用机制之一。
3.3 DR与VEGF的表达
VEGF是目前所知最强的内皮细胞选择性促有丝分裂肽和血管生成因子，可刺激血管内皮细胞增殖及移行、细胞外基质变性，诱导新生血管的形成。近年发现VEGF在DR中亦起着重要作用，涉及病变的各个阶段。本研究发现，VEGF在DR组视网膜中出现明显的表达，并随着病程的发展进行性表达增强，这也与Hammes 等[2]和Song等[9]的实验结果是一致的，表明VEGF参与DR的发病，并在DR的病理机制中发挥重要作用。既往研究发现，诸多因素如缺氧、胰岛素、糖基化终产物、生长因子等均可刺激血管平滑肌细胞、胶质细胞、内皮细胞等过度表达VEGF，其中缺血缺氧是最强的诱导因素[10]，在各种器官细胞和各种缺血缺氧模型均可见VEGF mRNA的表达。已知VEGF是HIF1的下游基因，两者相互作用的HRE（缺氧反应元件）位于VEGF5′端，HIF1与VEGF5′端结合后，不仅使VEGF mRNA稳定性增加，而且增强VEGF的转录活性[1,4]。本研究中VEGF mRNA在DR视网膜上的表达持续增强，这进一步提示，视网膜在缺氧条件下通过HIF1α的介导是DR中VEGF高表达的重要机制之一。
3.4 DR中HIF1/VEGF的低氧诱导信号通路
近年来研究发现，DR的发生、发展与视网膜血管生长因子表达异常而导致细胞增殖及新生血管的形成有关。DR的发生、发展是一个有序的、渐进的过程，其中视网膜缺血缺氧是一重要的病理机制。Treins等[11]发现小鼠腹腔内注射糖化白蛋白(AlbAGE)后，视网膜中出现VEGF表达增加，认为AlbAGE是通过激活HIF1α而刺激VEGF的高表达，并推测这条通路可能在DR的发展中起到重要作用。本研究通过建立糖尿病动物模型，进一步观察这一动态过程。我们认为，在DR发生、发展中，存在着HIF1/VEGF的低氧诱导信号通路，即视网膜的缺氧/缺血能诱导HIF1α的表达，进而激活HIF1的活性，启动HRG转录，参与缺氧诱导的一系列基因的表达调控[12]，如促进VEGF表达增强，从而介导DR的病理生理过程。这一通路中HIF1α的表达可能起到双面刃作用，一方面它促进细胞代谢，增强细胞对缺氧环境的适应能力，对保护细胞免受缺氧损伤具有积极的作用；另一方面，它诱导多种细胞因子的异常表达改变了局部正常的微环境，进而改变了正常的组织结构和功能，导致病变的进一步恶化。因此，如何调节HIF1α的适度表达对于DR的防治具有重要意义。
致谢：福建医科大学公共卫生学院李煌元博士。
【参考文献】
1 Forsythe JA, Jiang BH, Iyer NV, et al. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxiainducible factor 1. Mol Cell Biol1996;16:46044613
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3 Pugh CW, Ratcliffe PJ. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system. Nat Med2003;9:677684
4 Bracken CP, Whitelaw ML, Peet DJ. The hypoxiainducible factors: key transcriptional regulators of hypoxic responses. Cell Mol Life Sci2003;60:13761393
5 Zhang W, Liu NN, Xu JH. et al. HIF1α expression and retinal cell apoptosis in rat retina ischemiareperfusion injury. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi)2007;7(2):301304
6 Semenza GL, Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. Mol Cell Biol1992;12:54475454
7 Gross J, Rheinlander C, Fuchs J, et al. Expression of hypoxiainducible factor1 in the cochlea of newborn rats. Hear Res2003;183:7383
8 Ozaki H, Yu AY, Della N, et al. Hypoxia inducible factor1alpha is increased in ischemic retina: temporal and spatial correlation with VEGF expression. Invest Ophthalmol Vis Sci1999;40:182189
9 Song E, Li TY, Xu Q, et al. Expression of vascular endothelial growth factor in retinopathy of diabetic rats. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi)2003;3(3):912
10 Shima DT, Gougos A, Miller JW, et al. Cloning and mRNA expression of vascular endothelial growth factor in ischemic retinas of Macaca fascicularis. Invest Ophthalmol Vis Sci1996;37:13341340
11 Treins C, GiorgettiPeraldi S, Murdaca J, et al. Regulation of vascular endothelial growth factor expression by advanced glycation end products. J Biol Chem2001;276:4383643841
12胡建章,徐国兴,许建斌.糖尿病大鼠视网膜中缺氧诱导因子1α的表达与超微结构研究. 眼科研究 2007;2(2):8689 上一页 [1] [2] |
