【摘要】目的：观测兔眼正常玻璃体视网膜界面（VRI）基本的结构及相关生理。
方法：新西兰大白兔20只，应用皮肤及角膜接触镜电极作为记录电极，测定其视网膜电图(ERG)，记录其b波振幅（bA）值，并对其中4只眼的VRI结构进行组织病理学检查。
结果：正常的VRI包括紧密相邻的玻璃体后皮质（PVC）和视网膜内界膜（ILL），并有其各自的特点;两种记录电极得到的正常兔眼双侧ERG的bA值无统计学差异（P>0.05）。
结论：正常兔眼VRI的基本结构由PVC与ILL组成；ERG的bA值能较好地反映视网膜的生理功能。
【关键词】 视网膜；玻璃体视网膜界面；兔
Normal structure and related physiological parameters of vitreoretinal interface in rabbit eyes
GeFei Zhu1, Bo Qin2, XingHua Xi1, XiuZhen Zhou1
Foundation item: Science and Technology Plan Program of Shenzhen City, Guangdong Province, China (No.200603164)
1Department of Opthalmology, Shenzhen Peoples Hospital, the Second Affiliated Hospital of Jinan University, Jinan 518020, Guangdong Province, China; 2 Shenzhen Eye Center of Jinan University, Shenzhen Eye Hospital, Shenzhen 518001, Guangdong Province, China
Correspondence to: GeFei Zhu. Shenzhen Peoples Hospital, the Second Affiliated Hospital of Jinan University, Jinan 518020, Guangdong Province, China. [email protected]
AbstractAIM: To observe the normal structure and related physiological parameters of the vitreoretinal interface (VRI) in rabbit eyes. METHODS: The normal electroretinography (ERG) of 20 New Zealand rabbit eyes was measured, using two different kinds of recording electrodes. Also b wave amplitude values were recorded. Structures of VRI in 4 eyes of 2 rabbits were then checked with histological examination.RESULTS: Normal VRI consisted of posterior vitreous cortex (PVC) and its adjacent internal limiting lamina (ILL) of the retina, each had its own characteristic in the structure; and the use of two recording electrodes made no significant difference between right and left eyes. CONCLUSION: Normal structure of VRI in rabbit eye is composed of PVC and ILL and the bA value of ERG is a good index for investigating the physiology of the retina.
KEYWORDS: retina; vitreoretinal interface; rabbits
0引言
玻璃体与其后方的视网膜相邻，交界处由玻璃体后皮质（PVC）与视网膜内界膜(ILL) 等结构组成，这一交界区被称为玻璃体视网膜界面（vitreoretinal interface，VRI）[1] 。临床上的玻璃体后脱离（PVD）即发生于此界面。我们以新西兰大白兔作为实验动物，对正常兔眼VRI的显微结构以及与之相关的视网膜电生理进行观测，旨在为以后药物诱导形成PVD打下理论基础。
1材料和方法
1.1材料
体健无眼疾新西兰大白兔20只，由深圳市人民医院动物室提供，常规分笼饲养，体质量1.8～3kg，雌雄兼用，双眼均为实验眼。脱毛剂由硫化钠（湖南长沙坪塘化学试剂厂生产）8g+水100mL配成。麻醉剂：取戊巴比妥钠粉剂（北京通县育才精细化工厂生产）3g+注射用水100mL，配制成浓度为30g/L的溶液。采用国产直接眼底镜、裂隙灯；英国产Keeler间接眼底镜及日本产Topcon TRC50IA型眼底像机。视网膜电图测定采用重庆泰克公司TEC150V型视觉电生理诊断仪。光镜制片中采用英国产Shandon Citade l2000型自动脱水机及德国产Leica SM 2000R型切片机。日本产Hitachi H600型透射电镜。
1.2方法
实验兔双侧眼（40眼），在正常相同条件下，用直、间接眼底镜及裂隙灯观察眼前节、玻璃体和视网膜的大体外观形态。视网膜电图（ERG）测定 前，用脱毛剂脱去实验兔额正中部体毛，10g/L阿托品和100g/L新福林眼药水交替点眼2～3次，使瞳孔充分散大并暗适应1h。自兔耳缘iv 30g/L戊巴比妥钠溶液1mL/kg麻醉。实验眼充分开睑，置于全视野刺激球内中央处正前方，小心遮盖对侧眼使其避免一切光刺激。记录电极分两组（其中2兔4眼先后行两种电极检查）：一组10兔20眼采用银氯化银脑电图皮肤电极，置于下睑中央尽可能靠近眼球的皮肤上；另一组12兔24眼使用角膜接触镜电极，表面麻醉后在暗红光下置于角膜表面。参考电极与接地电极分别固定于额中、耳缘皮肤表面。电生理诊断仪的参数：刺激光闪光强度为13.7cd/m2，闪光间隔为2s,检测b波通频带为0.1～75Hz，记录波形放大5倍。结果由计算机自动处理分析并打印，记录b波振幅(bA)值。随机取2只实验兔，在双眼均完成上述检测后，用过量的30g/L戊巴比妥钠将其深度麻醉，摘除其4只眼球。然后15～20mL空气iv将之处死。3只摘出的眼球按常规浸入40g/L福尔马林液中固定48h后取出，将眼球前后向纵行剖分成3部分，取中间一份组织经脱水、透明、浸蜡和包埋制成石蜡标本；切片厚度为3～4μm；制片行染色及范吉逊苦味酸和酸性品红（VG）染色，显微光镜下观察玻璃体及视网膜的结构和形态。另在摘除的眼球中，随机取1只，置于4℃ 25g/L戊二醛固定液（pH=7.4）容器瓶中进行固定。固定前，12°方位用40黑丝线标记于角膜缘处；小心自基底部去除整个角膜，以利固定液渗入；同时，在切口四周缘缝以40丝线悬吊，固定于容器瓶口，以保持切口平稳向上，防止固定过程中造成机械性的结构分离。必要时，在摘除眼球的上方覆以脱脂棉，使标本完全浸入液体中。固定24h后，小心分离去除晶状体。充分清洗缓冲液，取中央部分的视乳头下方2mm处全层组织，10g/L锇酸固定液后固定。各级丙酮脱水，用Epon812包埋液进行浸透和包埋，半厚片定位后作超薄切片，醋酸铀及柠檬酸（枸橼酸）铅双重染色。在H600型透射电镜下观察VRI界面的超微结构。
统计学处理：记录正常兔眼分别使用两种记录电极检查所获的ERGs bA值，应用SPSS for Windows (11.0)软件包进行统计处理。两种电极组内（左右眼）行配对t检验，计量资料用均数和标准差（±s）表示，显著性检验水准以P<0.05为有意义。
2结果
2.1兔眼VRI的正常结构
正常兔眼的VRI包括PVC和ILL；PVC由致密的胶原细纤维构成，ILL位于视网膜的最内侧（即第10层）。光镜下HE染色可清楚地看见玻璃体的胶原情况及其邻近视网膜的基本结构(图1A)。透射电镜下，ILL由外往内可分为3个部分，即外层（纤维网状层）、实质层（致密层）和内层（透明层）。其外侧面（皮质的邻面）光滑，内侧面（视网膜侧）则由胶质细胞的不规则表面构成(图1B)。
2.2 bA值
左右眼ERG检查的bA值比较均无显著性差异（P>0.05,表1）。表1两电极组正常兔眼bA值比较（略）
3讨论
玻璃体是充填于眼球中央的细胞外基质，并与视网膜相邻。两者所形成的VRI有着很重要的病理学意义[2]：玻璃体对周边视网膜的牵引作用可以引起视网膜裂孔和/或脱离发生[3]；黄斑部玻璃体的牵拉则是产生黄斑裂孔的主要原因；细胞迁移、新生血管增生、增殖性玻璃体视网膜病变（PVR），以及黄斑前膜的形成也都发生在这一界面上。PVD则是此界面最常发生的一种重要的生理、病理性改变。自光学显微镜（LM）诞生（1590年）以来，一直被广泛应用于组织学检查中，它具有快速、廉价的特点。HE染色是其最常用的染色方法，虽然有学者认为，在研究玻璃体结构方面，VG染色更为有用，后者能较清楚地显示玻璃体的纤维结构，但本研究在HE染色片上亦清楚地显示出了玻璃体纤维的存在（图1A）。透射电子显微镜（TEM）的影像形成原理同光镜有一定的相似之处。但由于电子能穿透的厚度很小（约600～900nm），其标本制作要求高，因此TEM的检查较为费时、费钱。TEM的最小分辨率可以达到0.1nm，远远优于LM和扫描电镜（SEM），可以很好地显示VRI的结构。我们以TEM检查作为组织超微结构研究的主要手段和方法。本结果表明，在PVC与ILL相邻处所形成的交界区域（即VRI）中，PVC难以确定其分界，并没有真正解剖学上的“界膜”或“膜性结构”存在。所谓的“后界膜”实际上是PVC最外层邻近ILL处胶原细纤维密集、电子密度增高的部分。ILL的界限则比较明显，它是一种3层结构的组织（图1B）。这与国外文献[4]在TEM下对细胞基底膜观察的结果一致。故可以认为ILL在本质上就是视网膜Müller 细胞的基底膜。目前尚不清楚VRI界面间黏附力的确切来源。一般认为，玻璃体胶原细纤维是镶嵌入ILL内的。但我们发现兔眼的ILL厚度比较恒定，PVC的细纤维走向与视网膜表面基本平行，未见镶嵌于ILL致密层的胶原细纤维存在。因此，细胞外基质的组成部分在ILL与PVC之间很可能才是形成这种黏附作用的主要原因。由于兔眼的VRI界面间的黏附作用很强，这种动物一般不会自然发生PVD[5]。因此在研究VRI结构以及药物破坏玻璃体与视网膜间黏附作用的实验中，我们选择了兔眼这一有效而较为理想的模型作为研究对象。ERG在视觉电生理检查中具有代表性，它从视网膜的细胞水平来评价视觉功能，能综合反应视网膜的状态；其b波体现的是视感细胞兴奋后产生的电位变化，集中反应了双极细胞和Müller细胞的电活动，基本上可以代表视网膜的功能状态[6]。因此，本研究选用ERG的b波振幅（bA）值作为视网膜功能状态的观测指标。结果表明，正常兔双侧眼的 bA测量值无显著性差异（P>0.05）。
对正常VRI结构与相关生理的研究有助于对PVD的了解，后者是人类玻璃体最常出现的生理病理改变。尤其是对那些使得PVC与ILL相结合的细胞外基质成分，应进行进一步的研究，以了解玻璃体视网膜黏附作用产生的机制。这样就可按需调节该种黏附作用以阻止或者促进PVD的产生。
【参考文献】
1 Sebag J. Anatomy and pathology of the vitreoretinal interface. Eye1992;6:541552
2 Sebag J. Agerelated differences in human vitreoretinal interface. Arch Ophthalmol1991;109:970
3杨明明,滕岩,崔浩.孔源性视网膜脱离235例临床分析.国际眼科杂志 2007;7(6):17081710
4 Timpl R, Dziadek M. Structure, development, and molecular pathology of basement membranes. Int Rev Exp Pathol1986;29:8188
5 Cleary PE, Ryan SJ. Experimental posterior penetrating eye injury in the rabbit. Br J Ophthalmol1979;11:801
6吴乐正,吴德正.临床视觉电生理学.第1版.北京:科学出版社 1999:1720 |
