【摘要】 探讨IL1ra壳聚糖缓释剂对兔眼晶状体囊外摘除术后房水中炎性细胞因子IL1含量及后囊膜混浊的影响。
方法：将健康日本大耳白兔30只随机分为A，B，C3组，对右眼30只均行透明晶状体囊外摘除术，术中囊袋内分别注入缓冲液0.1mL（A组），注入5g/L IL1ra0.1mL（B组），置入IL1ra壳聚糖缓释剂一粒（C组）。分别于术后1，3，7，14，28，56，84d抽取房水0.1～0.2mL，用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法测定IL1的含量。定期裂隙灯显微镜观察角膜，前房及晶状体后囊膜混浊情况，术后84d处死白兔，做病理标本，行光镜及电镜检查。
结果：术后84d A，B，C组之间后囊膜混浊情况差别有显著意义（P<0.01）。房水中IL1含量测定表明B组较A组IL1峰值明显降低； C组与A组IL1含量差异显著，且C组呈持续下降趋势。光镜观察A组晶状体上皮细胞增生并有多层皮质纤维出现,B组偶见晶状体上皮细胞，C组晶状体后囊膜增生不活跃，囊膜光滑，后囊表面几乎无细胞及纤维蛋白粘附。
结论：IL1ra壳聚糖缓释剂具有抑制兔眼后发性白内障的作用，较单纯用IL1ra作用明显。
【关键词】 IL1ra 壳聚糖 缓释 IL1 后发性白内障
0引言
后发性白内障对术后远期视功能的严重影响日益受到广泛关注。目前多应用Nd :YAG激光切开后囊膜,但能够引起人工晶状体损伤、视网膜脱离、黄斑囊样水肿等并发症,并有约20%的患者因玻璃体支持作用而使晶状体上皮细胞移行,部分或全部关闭原切口,再次发生后发性白内障[1]。因此，研究能够有效防治后囊膜混浊且无毒副作用的药物有很大意义。我们将IL1ra与壳聚糖联合制成缓释剂（DDS），在手术中同期置入兔眼囊袋内，观察IL1ra壳聚糖DDS对兔后发性白内障的抑制作用。
1材料和方法
1.1材料
健康日本大耳白兔30只购于哈尔滨医科大学第一临床医学院动物实验中心，体质量1.5～2. 0kg，雌雄不限，标准喂养。将30只兔随机分为A，B，C3组，对右眼30只均行透明晶状体囊外摘除术。IL1ra，由四川成都诺迪康生物制药有限公司惠供。壳聚糖(上海其胜生物制剂实业公司)：1mL/支。IL1ra壳聚糖DDS的制备：取壳聚糖0.2mL与500μg IL1ra混合，用超声匀浆机乳化均匀，放入80℃深低温冰箱中冷冻12h，再立即移入冷冻干燥机（christ loc1m alphal4 isceon89）在50℃下真空干燥24h后，置干燥机中备用(同法制备单品20件)。IL1ra壳聚糖DDS单品呈淡黄色疏松海绵状，1mm×2mm大小。IL1 ELISA试剂盒购于美国BPB生物公司。
1.2方法
术前用美多利散瞳，10g/L戊巴比妥钠按1mL/kg耳缘静脉推注，实施全身麻醉。碘伏消毒术野,铺无菌孔巾，角膜缘内2mm做透明角膜切口，用5 号针头连续环形撕囊,直径为6mm,BSS液水分离,扩大角膜切口8mm ,娩出晶状体核,间断缝合切口,用Simcoe 双腔针头注吸残余晶状体皮质，切口水密缝合。根据实验要求囊袋内分别注入缓冲液0.1mL（A组），注入5g/L IL1ra0.1mL（B组），置入IL1ra壳聚糖缓释剂一粒（C组）。术毕,所有实验兔术眼结膜下均注射庆大霉素2万U + 地塞米松2mg ,上述3组手术均在手术显微镜下由一人完成。术后每天定时标准饲料喂养，观察兔全身和局部情况。于术后28，56，84d对术眼进行裂隙灯显微镜及眼底检查，观察后囊膜混浊情况。晶状体后囊膜混浊程度评分标准：0级：后囊无混浊；1级：后囊轻度混浊，眼底可看清；2级：后囊中度混浊，眼底仅可看清部分结构；3级：后囊重度混浊，无法看清眼底。分别于术后1，3，7，14，28，56，84d抽取房水0.1～0.2mL，于80℃保存，术后84d用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法测定IL1的含量，按试剂盒说明进行操作。于术后84d每组随机抽取2只白兔，处死后取实验眼至显微镜下剪除角膜，虹膜及晶状体后囊膜，将剪除的组织从中间一分为二，按常规分别做光镜和电镜标本，进行观察。
统计学处理：本实验所有数据均采用SPSS13.0统计分析软件处理。
2结果
2.1临床和后囊膜混浊情况观察
术后1d，部分兔术后眼有轻度角膜水肿，但均在3d内恢复。A组前房渗出较重，5～7d逐渐吸收，而B，C组术后则未见明显渗出。且C组DDS逐渐变小，未出现吸水膨胀，至84d时已消失。术后28d三组后囊膜混浊情况无显著差别（P>0.05）；56d时A组与另外2组后囊膜混浊情况差别显著(P<0.01)；84d时3组之间后囊膜混浊情况差别显著(P<0.01)。
2.2眼压的变化
A，B，C 3组各组内术前及术后3d眼压与术后1d眼压值比较差异有统计学意义(P<0.05)，而术后3d眼压与术前眼压值比较差异无统计学意义(P>0.05)。且相同时间点3组眼压值之间比较差异无统计学意义(P>0.05，表2) 。表1 兔眼晶状体摘除术后84d晶状体后囊混浊评分(略)表2 兔眼晶状体囊外手术前后眼压变化(略)
2.3房水中IL1含量
A组术眼房水中IL1含量术后增高，3～7d时达高峰，随后逐渐下降，56～84d左右达到稳定水平。测定结果表明B组较A组房水中IL1含量峰值明显降低（P<0.01）； C组与A组IL1含量差异显著，且C组含量呈持续下降趋势(表3)。表3 兔眼晶状体囊外摘除术后房水中IL1含量(略)
2.4组织病理学变化
术后84d时光镜观察：A组晶状体上皮细胞增生并有多层皮质纤维出现（图1A）；B组偶见晶状体上皮细胞；C组晶状体后囊膜增生不活跃，囊膜光滑，表面几乎无细胞及纤维蛋白粘附（图1B）。电镜观察结果示：透射电镜下A组晶状体上皮细胞胞质伸出长长的突起，核周可见丰富的粗面内质网，线粒体增多，提示细胞增生活跃。C组赤道部残留晶状体上皮细胞胞浆浓缩，核周隙增宽，粗面内质网少，线粒体肿胀且脊结构不清，呈空泡样改变，提示细胞增生不活跃。
3讨论
白内障摘出手术破坏了眼的血房水屏障，术中或术后释放出多种炎性细胞和细胞因子，诱发炎症反应促使残留的晶状体上皮细胞增殖和移行，并合成细胞间质，导致后发性白内障（PCO）。其中细胞因子IL1在这个过程中发挥了极为重要的作用。IL1作为一种重要的炎症介质，其含量超过一定限度，可破坏眼的前房相关免疫偏离机制，造成眼组织的损伤[2]。IL1能够极大地促进IL1，IL2，IL6，TNFa的分泌，加重术后炎症反应[3]，它刺激前列腺素产生增加，加重血房水屏障的破坏，并促进晶状体上皮细胞的有丝分裂及胶原合成[4]，增加合成细胞外基质的金属蛋白酶 [5]，增加合成晶状体囊膜的主要成分IV型胶原和层粘连蛋白[6]等，从而促进晶状体上皮细胞增殖，细胞外基质沉积及囊膜纤维化，最终形成PCO。
已知IL1ra是IL1的天然抑制剂，正常人体中就有IL1ra存在，它可以与细胞表面IL1 受体结合而不引发细胞内信号转导, 从而阻断IL1所引发的一系列生物学效应。且有实验研究表明IL1ra还有明显抑制细胞分泌IL6，IL8的作用[7]。Nishi等[8]研究表明，IL1ra能够抑制白内障术后炎症反应并明显抑制晶状体上皮细胞增殖。宫剑英等[9]利用IL1ra对兔眼PCO进行了实验研究，表明了IL1ra的抑制作用。我们的观察结果经统计学处理后显示，术后84d时A，B，C 3组PCO发生情况有统计学意义，A组后囊膜明显混浊，纤维化程度较重。房水中IL1含量测定结果显示：术后A组IL1含量明显较B、C两组高。光镜及电镜结果表明：A组赤道部及后囊膜晶状体上皮细胞显著增生，细胞功能明显活跃，胞浆粗面内质网含量丰富，而B，C两组则无此种改变。本实验进一步证明了IL1ra可通过特异性拮抗IL1，抑制炎症反应，从而抑制晶状体上皮细胞分裂增殖及胶原纤维的形成。
壳聚糖（chitosan）是甲壳素（chitin）脱乙酰基后的产物。近年来许多学者致力于各种眼用控释、缓释长效剂型的研究。壳聚糖凭借着稳定的理化性质、良好的生物相容性和可生物降解性，成为眼内应用的理想的药物缓释剂型，如：微囊，膜片，纳米微球等。尤其对于多肽和蛋白质类亲水药物而言，是较为理想的载体[10]。另外，壳聚糖本身还具有独特的生物活性，如:抑制纤维组织增生、抗微生物活性、免疫增强作用等。国内外学者已通过研究证明壳聚糖作为人工泪液、医用粘弹剂、眼用药物缓释制剂及在青光眼滤过术后抑制瘢痕化方面，有实验及临床意义。本实验采用冷冻干燥法[11]，制备了IL1ra壳聚糖缓释剂。壳聚糖在冷冻过程中冰晶从溶液中成核并线性生长，冷冻干燥时冰晶升华形成多孔结构[12]。这种多孔结构可用于蛋白质及肽类的释放，且蛋白质及肽类在冷冻干燥中不会发生生物学改变，使IL1ra在壳聚糖多孔支架中得到缓释。术后84d后囊膜混浊程度比较结果显示C组与B组后囊膜混浊情况有差异（P<0.05）；光镜结果示C组晶状体后囊膜表面几乎无细胞和纤维蛋白黏附，电镜示C组晶状体上皮细胞内细胞器少见，线粒体空泡变性，粗面内质网扩张。
我们首次将IL1ra与壳聚糖联合制成缓释剂型，使IL1ra随着壳聚糖空间结构的逐渐降解而释放，从而在一定时间内维持其在前房内的有效浓度，发挥抑制后发性白内障的作用。本实验结果表明IL1ra壳聚糖缓释剂能明显抑制晶状体上皮细胞的生长，比单独应用IL1ra预防后发性白内障的效果要好。本实验因为考虑到对照需要，C组与B组应用了相同浓度的IL1ra。在理论上，因为IL1ra从壳聚糖支架中缓慢释放，且IL1ra抑制IL1的效果在一定范围内具有剂量依赖性[6]，所以缓释剂中IL1ra的浓度完全可以再高一些。但在眼内应用何种浓度能够达到预防后发性白内障的理想效果，及IL1ra壳聚糖DDS释放速率的控制，尚有待于进一步的研究。
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