【摘要】目的：研究血管内皮生长因子小干扰RNA(VEGF small interfering RNA,VEGF siRNA)对兔眼碱烧伤后角膜新生血管的抑制作用。
方法：普通家兔25只以碱烧伤法（1mol/L NaOH溶液）诱导角膜新生血管（CNV）生成。碱烧伤后立即以脂质体（LF2000）为载体，右眼球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒，左眼球结膜下注射pSilencer 2.1U6 hygro空白质粒作为阴性对照。碱烧伤后1，3，5，7，14d，形态学分析评价角膜新生血管的生长情况。
结果：与对照眼相比，碱烧伤后球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒，实验眼在各时间段（3,5,7,14d），CNV长度明显变短，面积明显变小，差异有统计学意义（P＜0.05）。
结论：VEGF siRNA能有效地抑制碱烧伤后CNV的形成。
【关键词】 RNA干扰 角膜 新生血管 兔
0引言
角膜新生血管（CNV）形成是许多角膜疾病如角膜化学性烧伤、角膜炎或溃疡等共有的病理过程，常导致角膜透明性下降及明显的视力障碍。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是病理性新生血管形成的主要调控因子，目前通过调控VEGF的表达来抑制新生血管生长已成为研究的一大热点［1］。RNA干扰因能引起特异性同源性靶基因沉默［2］而成为主要的方法之一。我们采用VEGF特异性的小干扰RNA（VEGF siRNA）研究其对碱烧伤兔角膜VEGF mRNA的抑制作用，探讨其对角膜新生血管治疗的可行性。
1材料和方法
1.1材料 DL2000 DNA Marker（TaKaRa,日本）；脂质体LipofectamineTM（LF2000，美国Invitrogen公司）；VEGF干扰RNA表达质粒由GATAGAGCAAGACAAGAAA 序列插入pSilencer2.1U6 hygro 的BamHI和HindIII酶切位点构成（由美国Texas大学MD Anderson癌症研究中心Dr Zhou ZC惠赠）；空载体pSilencer2.1U6 hygro（Dr Zhou ZC惠赠）。普通家兔由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。
1.2方法 取普通家兔25只，雌雄兼用，体质量2.0～2.5kg, 用裂隙灯显微镜检查兔眼角膜正常。先制备角膜碱烧伤动物模型。然后25只兔随机分为5组，每组5只，构成碱烧伤后1，3，5，7，14d组。30g/L戊巴比妥钠（30mg/kg）兔耳缘静脉注射麻醉,5g/L丁卡因滴眼液点眼2次表麻后,棉签吸除结膜囊液体,将统一规格直径10mmWhatmanⅢ滤纸片浸泡于1mol/L NaOH溶液中1min,达饱和状态,棉签吸去多余的NaOH液，然后置于兔子双眼角膜中央1min,取下滤纸,用生理盐水冲洗角膜及结膜囊2min, 制备角膜碱烧伤动物模型。按以上步骤制备角膜碱烧伤动物模型后随即每只兔右眼四个象限球结膜下各注射VEGF siRNA（500mg/L）与Lipofectamine（LF2000）混合液10μL（体积1∶1，混匀，注射前室温下静置30min）,共计40μL，左眼四个象限球结膜下各注射pSilencer2.1U6 hygro（500mg/L）与Lipofectamine（LF2000）混合液10μL（体积1∶1，混匀，注射前室温下静置30min）,共计40μL，以后双眼隔天注射1次。术后3d每日滴抗生素眼药水及眼膏预防感染。兔眼球结膜下注药24h后，每日用裂隙灯显微镜观察双眼新生血管发生的情况,至出现CNV后，改为隔日观察，每次均测量自角膜缘长出的CNV长度并记录、照相。测量时，以连续弯曲度小、CNV朝向角膜混浊中心生长的最长血管为准，并计算CNV生长面积A，A=C/12×3.1416［r2（rl）2］,其中C为CNV累及角膜的圆周钟点数,l为CNV从角膜缘伸入角膜的长度, r为角膜半径。
统计学处理：各组数据均以表示，两组间均数的比较采用配对t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
双侧CNV兔模型左眼球结膜下注射pSilencer2.1U6 hygro空白质粒（对照组），右眼球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒（实验组）后各组CNV变化如下：肉眼下术后1d ，双眼碱烧伤斑明显，可见角膜上皮损伤，角膜水肿，角巩膜缘血管轻度扩张充血；术后3d,左眼可见局部角巩膜缘处有新生血管芽向角膜中心生长,角巩膜缘血管扩张充血较前明显，右眼角巩膜缘除血管扩张充血外，几乎看不见新生血管芽萌出；术后5d,左眼角巩膜缘处新生血管已明显变长，顶端已出现分叉，右眼角膜缘四周也有新生血管向中心生长，但较左眼为短。术后7d,左眼新生血管迅速增长，其顶端分叉更加明显，部分交织成网状，局部血管已侵入碱烧伤斑，右眼情况类似，但较左眼明显为短。术后14d,左眼角膜新生血管呈垂柳状从四周长入碱烧伤斑，占据大部分角膜，但新生血管变得细而稀疏。右眼新生血管较左眼明显要短,要稀疏，尤其质粒注射部位几乎没有血管生长（图1）。以前述方法测量双眼CNV长度并计算其生长面积, 角膜碱烧伤后3，5，7，14d，实验组CNV长度及其生长面积明显小于对照组（P﹤0.05，表1）。
表1 兔碱烧伤后角膜新生血管长度和面积比较（略）
aP＜0.05vs对照组
图1 碱烧伤后角膜新生血管的形态学观察（略）
3讨论
角膜新生血管（CNV）增殖是许多角膜病变如角膜化学性烧伤、角膜炎或溃疡等共有的病理过程，严重影响视力，同时也是导致角膜移植后排斥反应的首位高危因素［3,4］。最近，大量研究证实了VEGF在血管形成中的重要作用。VEGF是一种具有自分泌和旁分泌机制的生长因子，它的基因定位于染色体6p21.3，全长14kb,由8个外显子和7个内含子组成，编码产物为34～42kDa的同源二聚体糖蛋白，亚基之间通过二硫键相连。VEGF可使血管内皮细胞增殖，微静脉通透性增加，细胞质钙聚集，诱导血管生成。因此，目前对角膜新生血管的防治主要是围绕抑制VEGF的表达来进行。在众多抑制基因表达的方法中, RNA干扰以其特有的优势而备受青睐。RNA干扰（RNA interference）是一种高度序列特异性的转录后基因沉默，它是由小干扰RNA（small or short interfering RNA,siRNA）诱导引起的同源基因抑制。siRNA由21～23个核苷酸组成，通过结合与其有互补序列的mRNA并使之降解来达到抑制靶基因表达的目的。相比于反义RNA、核酶和基因敲除等抑制基因表达法，siRNA诱导产生的RNAi具有高特异性、高效率和高成功率的优点：(1)高特异性：siRNA能选择性地引起靶基因mRNA的降解，选择是高度特异的。siRNA有3bp以上碱基错配就不能诱导产生RNAi,有时，甚至一个碱基的突变就会大大降低靶基因的封闭效果［5］；(2)高效率：线虫实验表明，RNAi可以在细胞之间传递并维持，甚至可以传至下一代，所以在细胞内RNAi途径一旦被激活，反应信号就可以被一定程度地扩增和放大［6］。有人甚至提出最低每个细胞一份拷贝的siRNA就可以封闭靶基因的表达。但此传代和放大作用在哺乳动物细胞中尚未得到证实；(3)高成功率：RNAi已经被用于线虫全基因的功能分析，研究结果表明，其中50%～80%序列选择有效，12.9%～27%的基因封闭产生了明显的异常表型。我们所用基因转染载体为脂质体。考虑到脂质体作为载体有下述优点：(1)无细胞毒性，制备简单；(2)体内代谢慢，存留时间长；(3)包裹基因容易、简便，可携带较大的DNA分子，保护目的基因不被核酸酶降解；(4)能转染的细胞类型多，而且靶细胞不需处于分裂状态。我们采用的LipofectamineTM（LF2000）脂质体，这是一种特制的阳离子脂质体试剂，其与靶DNA的磷酸骨架结合生成的复合物具有能轻易通过细胞膜从而完成转染过程的特性，转染能力很强。
本实验结果显示，碱烧伤后1d,对照组左眼角膜缘附近的血管扩张，3d角膜新生血管开始形成,5，7d新生血管逐渐增多，14d时角膜新生血管化最为严重。实验组右眼球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒后，角膜新生血管的长度在碱烧伤3d后各时点均比注射pSilencer2.1U6 hygro空白质粒的左眼明显要短，CNV面积明显要小，时间越长差别越明显，至14d时,左眼角膜新生血管呈刷状全部长入碱烧伤斑，占据大部分角膜，而右眼新生血管较左眼明显要短且稀疏，尤其质粒注射部位几乎没有血管生长。这说明球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒可以抑制碱烧伤后CNV的形成，其抑制作用可能是通过下调VEGF mRNA的表达来实现的，其调控机制尚在进一步研究之中。
综上所述，采用球结膜下注射脂质体介导的VEGF siRNA重组质粒，可有效地抑制CNV，方法简便易行，治疗效果明显，具有一定的临床应用前景。
【参考文献】
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3 Weisbrod DJ, Sit M, Naor J, Slomovic AR. Outcomes of repeat penetrating keratoplasty and risk factors for graft failure. Cornea,2003;22(5):429434
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