【摘要】 目的：比较连续性光照射与间歇性光照射对大鼠视网膜的影响，探讨视网膜光损伤的发生机制。
方法：Wistar大鼠，雌性，8～10wk 42只，随机分为正常对照组，连续性与间歇性损伤组，用强度为2 380±569lx绿色荧光灯为致伤光源，连续光照射24h建立连续性光损伤模型；光照射3h，暗适应3h，反复8次建立间歇性光损伤模型。光照射后3，7，14d取材，石蜡包埋、HE染色，图像分析仪测量视网膜外核层厚度。
结果：正常Wistar大鼠视网膜形态正常，结构层次分明，内外节排列整齐，分界清晰，内外核层排列紧密，外核层厚度为43.5±1.4μm；经过24h光照射后，各个时段均有明显的病理改变，主要表现为：内外节结构紊乱，分界不清，外核层细胞核间隙增大，外丛状层及外核层均变薄。连续性损伤后3，7，14d视网膜外核层厚度分别较正常减少13.9%，34.0%，35.8%；间歇性损伤后3，7，14d视网膜外核层厚度分别较正常减少20.6%，40.8%，47.1%。间歇组与连续组同一时间段外核层厚度相比均有显著差异。
结论：间歇性光照射对视网膜损伤较连续性光照射重；视紫红质可能参与并介导了视网膜光损伤。
关键词：大鼠；视网膜光损伤；连续性；间歇性；外核层
0引言
视网膜是接受光能、形成视觉的重要组织结构，但如果光线强度或光照时间等超过了视网膜的承受力，将会造成视网膜光损伤。视网膜光损伤的概念早在柏拉图时代就提出，直到1966年Noell等［1］才开始实验室研究。近年来，随着眼科光学诊疗器械和显微手术应用的增多，各种器械光源所致视网膜损伤等问题越来越引起人们的注意，特别是光损伤的病理过程与年龄相关性黄斑变性及视网膜色素变性有许多相似之处［2］，因此对视网膜光损伤的深入研究有着重要的临床和理论价值。近年，国内外学者对视网膜光损伤进行了大量的实验研究，并取得了一定的成果，实验研究通过连续光照射建立动物模型［3-7］，然而我们人类主要是生存昼夜交替的自然环境中，因此，对间歇性光照射导致的视网膜损伤进行研究，具有更重要的意义。我们用2 380±569lx绿色荧光灯建立Wistar大鼠视网膜连续性及间歇性光损伤模型，观察到连续性光照射及间歇性光照射后视网膜外核层(outer nuclear layer, ONL)厚度变化，比较持续性光照射与间歇性光照射不同，探讨视网膜光损伤的发生机制。
1材料和方法
1.1材料 采用解放军昆明总医院动物科提供的健康雌性Wistar大鼠42只，鼠龄8～10wk，体质量192～219g，检查无眼疾，实验大鼠随机分成正常对照组，连续性光照后3，7和14d损伤组，间歇性光照后3，7和14d损伤组，每组6只12眼。
1.2方法 采用自制光损伤装置（1m×1m×1m），在光照箱的5个面（除底面）分别装有两个12W的绿色荧光灯，光照箱的底面有16个直径为0.8cm 的通风孔，玻璃框放置在光照箱的底面中央，玻璃框中平均的光照度为2 380±569lx，光照射箱的温度在24～28℃。所有的实验用大鼠（包括正常对照组）均在12h明（90～150lx）及12h暗(0 lx)循环光适应1wk；光照射前暗适应24h，然后接受光照射，所有大鼠未经散瞳及麻醉，可以在光照箱中央的玻璃框中自由活动，可以自由饮水及进食。分批接受光照射：a连续组：连续光照射24h；b间歇组：光照射3h后暗适应3h，再接受3h光照射，再暗适应3h，如此循环8次，总的光照射时间为24h。光照射结束后所有大鼠均送回暗环境中饲养。正常对照组于光照射前取标本，损伤组于光照射后3，7，14d取标本。30g/L戊巴比妥钠按1ml/kg ip麻醉，在大鼠眼球的12点位球结膜用5-0黑色缝线作标记，迅速摘除眼球（包括球后视神经约3mm）立即放入40g/L多聚甲醛溶液中，左右眼球分别放置，断颈处死大鼠。在40g/L多聚甲醛溶液中固定48h后，去除眼前节和玻璃体，逐级酒精脱水，常规石蜡包埋，经视乳头颞侧旁1mm纵向做切片。 常规HE染色。每张HE染色切片随机选择5个视野，采用计算机图像分析系统观察视网膜结构改变，并测量外核层的厚度，求其均值代表这张图片的视网膜外核层的厚度，并以此作为视网膜光感受器丧失的判断指标。
统计学处理：各项指标以均数±标准差（±s）表示；同一组内比较用单因差分析，两组同一时间点采用t检验，P＜0.05表示有显著差异。
2结果
2.1光镜下观察 Wistar大鼠视网膜形态正常，结构层次分明，光感受器细胞内外节排列整齐规则，分界清晰，内外核层排列紧密，染色均匀，细胞形态规整（图1A）。连续性光照射后3d光镜下观察：光感受器细胞内外节水肿，结构稍紊乱,轻度空泡变性，外核层光感受器细胞核减少,排列稀疏，ONL厚度较正常减少，外丛状层变薄（图1B）。连续性光照射后 7d光镜下观察：光感受器细胞内外节结构明显紊乱,外节明显空泡变性， 外核层光感受器细胞核继续减少, 细胞核排列稀疏，ONL变薄，外丛状层薄（图1C）。连续性光照射后14d光镜下观察：光感受器细胞内外节明显变短，结构紊乱,分界不清，与连续性光照射后7d相比，外核层光感受器细胞核稍致密，但仍比正常稀疏, ONL变化不明显，外丛状层薄（图1D）。间歇性光照射后3d光镜下观察：光感受器细胞内外节水肿、结构明显紊乱,内外节均可见空泡变性，与正常对照组相比外核层光感受器细胞核减少, 细胞核排列稀疏，ONL层及外丛状层均变薄（图1E）。间歇性光照射后7d光镜下观察：光感受器细胞内外节分界不清，结构明显紊乱,空泡变性明显，外核层光感受器细胞核继续减少, 细胞核排列不规则且稀疏，ONL层进一步变薄，部分外丛状层消失（图1F）。间歇性光照射后14d光镜下观察：光感受器细胞内外节变短，结构明显紊乱,分界不清，可见大的空泡变性，外核层厚度与内核层厚度相近，光感受器细胞核减少,外核层细胞核排列极不规则且稀疏，外丛状层几乎消失（图1G）。
2.2视网膜ONL层厚度变化 正常大鼠视网膜ONL层厚度为43.5±1.4μm,连续性光照射后3d视网膜ONL层厚度减少13.9%（37.4±1. 6μm），连续性光照射后7d视网膜ONL厚度进一步减少34.0%（28.7±1.5μm），连续性光照射14d后视网膜ONL的厚度较正常对照组减少35.8%（27.9±1.3μm），与连续性光照射后7d相比，无显著差异，P＞0.05；间歇性光照射后3d视网膜ONL厚度与正常对照组相比减少20.6%（34.5±1.2μm），间歇性光照射后7d视网膜ONL厚度进一步减少40.8%（25.8±1.3μm），间歇性光照射后14d视网膜ONL层厚度仍进一步减少，减少幅度为47.1%（23.0±1.4μm）；两损伤组3，7，14d视网膜ONL层厚度与正常对照组相比均有极显著差异，P＜0.01，间歇性光照射后3，7，14d ONL层均比连续性光照射同一时间点ONL层薄，两两相比均有极显著差异，P＜0.01。
3讨论
“日光性视网膜病变的概念” 最早出现在18世纪文献中，直到1966年Noell等［1-6］首次建立了大鼠视网膜光损伤的动物模型。由于视网膜是眼组织中最易受到光损伤的部位，同时许多视网膜变性疾病如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性等与视网膜光损伤有相似的病理过程，以及近年来眼科光学诊疗仪器如手术显微镜、间接检眼镜及眼内导光纤维在临床普遍应用，医源性光损伤报道增多［9,10］，视网膜光损伤日益受到人们重视，因此视网膜光损伤及其损伤防御机制和药物性防治的研究是近年眼科领域的一个重要的研究课题。Wenzel等［11］实验证明高强度的光照可引起视网膜光感受器细胞的凋亡,加快年龄相关性黄斑变性、遗传性视网膜色素变性等相关疾病的进展。近年国内外许多学者进行了大量的视网膜光损伤方面的研究，但关于光性视网膜损伤的机制尚不清楚。目前视网膜光损伤研究中较为常用的动物模型是连续性光照射模型，即用连续光照射24h或36h，光照射结束后，分别在不同的时段取材来观察视网膜结构及相关指标的改变，然而，我们人类是生存在昼夜交替的自然环境之中，因此，间歇性光照射模型更接近人类生存状态，对其研究更有实用价值。国外学者已经开始研究间歇性光照射对视网膜功能及结构的影响，并取得了一定的科研成果，如在相同的条件下比较连续性光照射与间歇性光照射对视网膜的影响，这对研究视网膜光损伤的发生机制及如何预防视网膜光损伤都具有重要意义。
图1 光照射对大鼠视网膜的影响（HE×400）（略）
A：正常；B：连续光照3d；C：连续光照7d；D：连续光照14d；E：间歇光照3d；F：间歇光照7d；G：间歇光照14d
本实验的光损伤装置的特点是，只在光照箱的5个面安装荧光灯（底面未装），而传统的光损伤装置的底面安装有荧光灯，这样改装可以降低底面荧光灯长时间照射造成光损伤装置的温度升高，因为温度升高可以增加视网膜光损伤的易感性（温度每升高2℃视网膜损伤阈较正常体温降低5～10倍［12］），另外改装还可以增加光损伤装置的稳定性和安全性（传统光损伤装置的玻璃框悬于光照箱中央［13］），经数字式光度计测量各个方向水平光照强度均能达到实验要求。本实验致伤光源采用波长为510～560nm 的绿光, 是因为绿光位于人类日常生活中经常接触的可见光光谱的中段, 其研究结果接近于可见光对视网膜的损伤。实验前, 动物在12h明及12h暗循环光环境适应7d,在光照期间动物能自由活动, 不麻醉、不散瞳等, 其目的在于模拟正常生活状态, 减少人为因素对实验结果的影响。我们观察到，连续性光照射和间歇性光照射各个时间段均可见视网膜明显的病理改变，主要表现为：内外节结构紊乱，分界不清，外核层细胞核间隙增大，光感细胞核排列不规则且稀疏, 外丛状层及外核层均变薄。损伤组ONL层厚度与正常对照组相比均有显著差异（P＜0.01），说明Wistar大鼠经过24h、强度为2 380lx的绿色荧光灯照射后可以造成视网膜损伤，连续性光照射后14d与连续性光照射后7d相比无显著差异（P＞0.05），说明连续性光照射后14d外核层细胞已经有一定的损伤修复功能，此时已进入损伤修复期，但未能完全恢复正常，这与谢伯林等［14］研究结果相一致。间歇性光照射后各个时间段相比ONL厚度的变化均有显著性差异（P＜0.01），说明间歇性光照射后14d视网膜损伤仍在继续。连续性光照射与间歇性光照射后各个同一时间点视网膜ONL层厚度相比均有显著差异，说明间歇性光照射后视网膜损伤比连续性视网膜光损伤更严重，这与Orangiscisk等［15］研究结果相一致；连续性光照射组与间歇性光照射组在光源、光的强度、光照射时间及温度等条件均相同，不同的是间歇性光照射组经过了7次暗适应（3h/次），说明暗适应能够增加视网膜光损伤，连续性光照射使视紫红质漂白，视紫红质水平下降，而间歇性光照射后视紫红质漂白，但暗适应能增加视紫红质合成，因此本实验提示视紫红质可能参与并介导了视网膜光损伤。HE染色切片可以观察到富含视紫红质的光感细胞外节最先出现损伤，表现为水肿、空泡、结构消失，内节的变化与之相比则较轻。Noell等［1］最先建立大鼠光损伤模型所采用的损伤光源是波长为500nm的绿色荧光灯,观察到最先损伤部位是光感受器外节，由于此部位含有大量的视紫红质，其吸收光谱与绿光损伤作用光谱相似，因而他认为损伤是由视紫红质介导。Noell等［16］进一步观察到大鼠在光照前暗适应2wk可造成更严重的损伤，这与大鼠暗适应后视网膜含有高水平视紫红质有关。Organisciak等［15］ 在比较连续性光照射与间歇性光照射的实验中发现，经过相同的光照射后间歇性光照射组的大鼠视网膜视紫红质水平较连续性光照射组低，且间歇性光照射导致视细胞的损伤是连续性光照射的两倍。Theodore等［17］在研究中发现，用486nm和560nm的可见光分别照射大鼠，结果发现486nm可见光导致大鼠整个视网膜ONL层变薄，较560nm可见光明显，而486 nm可见光接近视紫红质最大吸收光谱，因此他认为视紫红质介导了视网膜光损伤。Organiscsiak 等［18］研究也表明导致光损伤的光谱与视紫红质的吸收光谱一致。Grimm等［19］研究证实缺乏视紫红质的小鼠不出现光损伤诱导的感光细胞凋亡，他认为视紫红质在光诱导小鼠视细胞凋亡的胞内信号的产生和转导中起要作用，Joseph 等［20］动物实验研究发现，转基因鼠光感受器细胞通过bcl2过表达减少视杆细胞内视紫红质含量，可以起到抗视网膜光损伤的作用。Noell等［21］的研究发现缺乏维生素A的大鼠比正常饮食大鼠对光损伤更具耐受性。关于视紫红质介导视网膜损伤的机制目前尚不清楚，许多前期的研究认为：光感受器细胞外段处于高张氧环境中，并富含不饱和脂肪酸—二十二碳六烯酸，当光子被视紫红质吸收后可激发电离，产生单线态氧、过氧化氢及羟自由基等，自由基作用于盘膜发生脂质过氧化［22］，正常情况下机体内自由基的产生与清除处于动态平衡，如果外界因素将这平衡打破，将导致机体损伤，当过强或过长时间光照射，自由基的产生超出了机体清除能力将引起视网膜光损伤，实验研究表明抗氧化剂能够减轻光照所致的视网膜脂质过氧化，对视网膜损伤有保护作用［23］。
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