作者：郭燕，王万辉   

    作者单位：（030001）中国山西省太原市，山西医科大学第二医院眼科

    【摘要】  目的：探讨重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin, rhEPO）预处理对大鼠急性高眼压视网膜损伤的保护作用及其机制。

    方法：选用健康成年雄性Wistar大鼠36只，随机分为正常组4只（不做任何处理直接处死），生理盐水组16只（造模前3h ip生理盐水），rhEPO组16只（造模前3h ip rhEPO）。采用生理盐水前房加压灌注法升高大鼠眼压至100mmHg并维持60min，于造模成功后6，24，48，72h分别处死动物摘取眼球制作视网膜石蜡切片。HE染色观察视网膜组织的形态学改变；分别采用TUNEL法和免疫组化法观测凋亡细胞和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)在视网膜中的表达和分布，并利用计算机图像分析系统量化检测指标，进行统计学分析。

    结果：急性高眼压造成大鼠视网膜损伤，生理盐水组大鼠视网膜内层变薄，所占整个视网膜的百分比较正常组下降，rhEPO组视网膜内层所占百分比较生理盐水组大，差异有统计学意义（P <0.01）；正常组大鼠视网膜未见TUNEL阳性细胞，生理盐水组和rhEPO组在神经节细胞层、内核层均可见TUNEL阳性凋亡细胞，但rhEPO组与生理盐水组比较，TUNEL阳性细胞减少，差异有统计学意义（P <0.01）。正常组视网膜p-Akt有弱表达，生理盐水组和rhEPO组在神经节细胞层、内网层、内核层均可见p-Akt阳性细胞，但rhEPO组比生理盐水组表达增强，差异有统计学意义（P <0.01）。神经节细胞层与内核层p-Akt的表达较内网层强。

    结论：rhEPO预处理可减弱高眼压对视网膜造成的损伤，减少和延缓细胞凋亡的发生，其可能的机制是通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信号传导通路上调p-Akt来抑制凋亡的发生。

    【关键词】  促红细胞生成素(EPO)；视网膜；高眼压；TUNEL；磷酸化蛋白激酶B

    The protective function of erythropoietin to the rat retina after acute intraocular hypertension

    Yan Guo, Wan-Hui Wang

    Department of Ophthalmology, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

     Abstract AIM: To investigate the protective function and mechanism of recombinant human erythropoietin (rhEPO) pretreatment on the rat retina with acute intraocular hypertension injury. METHODS: Thirty-six healthy male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: normal group (n =4, killed directly without any treatment), saline group (n =16, physiological saline was administered i.p. 3 hours before raising intraocular pressure [IOP]), rhEPO group (n =16, rhEPO was administered i.p. 3 hours before raising IOP). Either of bilateral eyes was randomly made into the acute high IOP model using the method of saline perfusion into anterior chamber until the IOP reached 100mmHg, then sustained the IOP for 60 minutes. All the rats were killed respectively and the eyeballs were enucleated at different observation periods after the model was successfully established (6, 24, 48 and 72 hour). The histological changes of retina were observed by HE staining; the expression and distribution of apoptotic cells and p-Akt protein were observed respectively by using TUNEL detection and immunohistochemistry. The data was statistically analyzed. RESULTS: ①The acute high IOP damaged the rat retina, the inner layer of retina got thinner and its percentage of whole retina was decreasing in the saline group, but the percentage of the rhEPO group was bigger than that of the saline group, the difference was significant (P <0.01); ②No TUNEL-positive cells were seen in the normal group, the apoptotic cells of the other two groups were observed in the retinal ganglion cell layer (RGL) and inner nuclear layer (INL). There were less apoptotic cells in the rhEPO group than those in the saline group, the difference was significant (P <0.01); ③The minute expression of p-Akt protein was found in the normal group, while the p-Akt positive cells which were expressed in the RGL, inner plexiform layer (IPL) and INL were observed both in the saline group and the rhEPO group. There were stronger expression in the rhEPO group than those in the saline group, the difference was of significance (P <0.01). The expression of p-Akt in RGL and INL is stronger than that in IPL. CONCLUSION: The damage caused by the acute intraocular hypertension was mainly occurred in RGL, IPL and INL, while rhEPO pretreatment can lessen the damage and the cell apoptosis. The mechanism of rhEPO's protective function may be the activation of PI3K/Akt signaling pathway and up regulation p-Akt in retina, which can restrain cell apoptosis.

    · KEYWORDS: erythropoietin (EPO); retina; intraocular hypertension; TUNEL; p-Akt

    0引言

    青光眼（glaucoma）是以视神经形态学改变为特征的病变，即视杯扩大、视野缺损、视网膜神经纤维减少和视网膜节细胞（RGC）丢失。青光眼的主要危险因素有：眼压升高、遗传因素、近视眼和种族因素等。众所周知，眼压在青光眼的发病过程中起着至关重要的作用[1]。由于眼压是相对容易控制的危险因素，因此目前对青光眼的治疗主要是通过手术或药物，降低眼压。但由于眼压不是青光眼发病的唯一危险因素，部分在眼压得到控制后，视神经萎缩和视野缺损仍然进行性发展，因此全面的青光眼治疗应包括视神经保护[2]。神经保护（neuroprotection）是一种延缓或阻止神经元死亡的治疗模式，最简要的视神经保护方法是针对是神经损伤发生的不同环节，应用不同的神经保护剂，阻断视神经损伤的发生，而目前神经保护的研究尚处于探索阶段[3]。促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是调节红细胞生成的糖蛋白，主要产生于胎儿的肝脏和成人的肾脏，EPO和它的受体（EPOR）主要存在于骨髓的造血干细胞并刺激它向红细胞分化。但最近的研究表明，功能性的EPOR在许多的组织和器官中都有表达，包括神经系统的神经细胞，视网膜的神经元等。EPO和EPOR在脑缺血、缺氧和贫血时表达上调，暗示它有内源性神经保护作用[4]。目前国内外已有研究表明，给予外源性的rhEPO可对损伤的大脑和脊髓发挥保护作用，但rhEPO对急性高眼压视网膜损伤是否有保护作用国内外鲜有报道。我们通过急性高眼压动物模型，观察高眼压对视网膜的损伤和rhEPO对损伤视网膜的作用，并对其可能的机制进行探讨，从而为青光眼的视神经保护和其他视神经疾病治疗提供实验依据。

    1材料和方法

    1.1材料 健康成年雄性Wistar大鼠36只，体质量（220± 20）g，要求动物双眼等大、角膜透明、瞳孔等大等圆、虹膜血管清晰、晶状体无浑浊。由山西医科大学实验动物中心提供，饲养在正常昼夜周期环境中。重组人促红细胞生成素（rhEPO:4MU/L）；TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒（In Situ Cell Death Detection Kit,POD，德国Roche公司）；一抗：phospho_Akt(Ser473)(736E11)Rabbit mAb(IHC Specific)（美国Cell Signaling公司）；免疫组化二抗试剂盒（Histostain_Plus Kit,晶美生物工程有限公司）；蛋白酶K（美国Amresco公司，大连宝公司代理）；倍诺喜滴眼液（盐酸奥布卡因，日本参天）；多聚赖氨酸防脱磨砂玻片（北京中杉金桥生物技术有限公司）；其它药品及试剂由山西医科大学设备科和山西医科大学第二医院眼科提供。

    1.2方法 Wistar大鼠36只随机分为正常组4只（不做任何处理直接处死）， rhEPO组16只，生理盐水组16只。再依造模成功后取材时间将rhEPO组和生理盐水组大鼠随机分为6，24，48和72h组，每组4只。rhEPO组大鼠在造模前3h ip rhEPO 5 000U/kg；生理盐水组大鼠ip等体积的生理盐水。急性高眼压动物模型的制作: 32只Wistar大鼠称质量，10g/L戊巴比妥钠按40mg/kg ip全麻，实验中追加量为15mg/kg。麻醉满意后，将大鼠俯卧位固定于手术台上，随机选取每只大鼠的一眼造模，复方托品酰胺散瞳后，结膜囊内滴倍诺喜滴眼液2次，眼表面麻醉妥后将连接生理盐水瓶输液管的4号半头皮针沿颞侧角巩膜缘刺入大鼠眼前房,针头斜面向上以避免损伤虹膜和晶状体，胶布固定头皮针于大鼠同侧耳缘处，然后打开输液器，缓慢升高输液瓶至与大鼠实验眼垂直距离为136cm 处,此高度可在眼内形成100mmHg的眼压。观察并监测使输液瓶内的液体无向眼内滴注,此时可见球结膜及虹膜迅速变白,检眼镜检察发现视网膜苍白水肿,说明视网膜中央动脉的供血已被完全阻断。氯霉素滴眼液滴眼以保持角膜湿润并预防感染。持续形成高眼压造成视网膜缺血 60min 后,缓慢降低输液瓶高度至大鼠眼水平，使眼内压缓慢降低。关闭输液器，拔出输液针头,虹膜及球结膜颜色迅速恢复正常,检眼镜观察眼底可见视网膜呈橘红色,说明阻断的血管重新开放,已形成再灌注。术毕结膜囊涂红霉素眼膏.待清醒后回笼。将各组实验动物分别于观察期满后，10g/L戊巴比妥钠ip深麻大鼠并固定，分离眼周组织，定位颞侧，迅速完整取下眼球及眶内段视神经，置于冰生理盐水中清洗残留于组织表面的血污，然后将整个眼球放入盛有40g/L多聚甲醛的标号青霉素瓶中固定，4℃过夜后在解剖显微镜下沿角膜缘剪开眼球小心去掉前节制成眼杯，将眼杯在40g/L多聚甲醛中继续固定48h。标本常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋。将包埋好的眼球标本，由鼻侧至颞侧做与视神经矢状轴平行的视网膜连续切片，切片厚5μm，取经视神经平面的切片捞于多聚赖氨酸防脱载玻片上，70℃温箱中烤片，供HE染色、TUNEL和免疫组化使用。

    1.2.1 TUNEL法检测细胞凋亡 方法参照试剂盒（德国Roche）说明，具体步骤如下：石蜡切片常规脱蜡、水化；用蛋白酶K（20mg/L溶于Tris/HCL中，pH7.4～8.0）37℃温箱孵育15min，PBS洗3次，每次3min；擦干样品周围的水，滴加TUNEL反应混合液（在使用前立即配置：试剂1 酶浓缩溶液和试剂2 标记溶液按照1∶9的配比关系配置，配好的此液体必须放入冰浴中），在湿盒中37℃孵育60min，PBS洗3次，每次3min；擦干样品周围的水分，加入试剂3 转化剂-POD，在湿盒中37℃孵育25min，PBS洗3次，每次3min；加入DAB显色液（用时按说明书比例进行配置），镜下控制反应时间，PBS洗；苏木素复染20s，水洗，盐酸酒精分化，稀氨水返蓝，脱水、透明、封片，显微镜下观察。阴性对照：以试剂2标记溶液代替TUNEL反应混合液，从标记步骤以下同上。

    1.2.2免疫组化法检测磷酸化蛋白激酶B 检测p-Akt方法参照试剂说明书，具体步骤如下：石蜡切片常规脱蜡、水化；抗原修复采用高压热修复的方法，将切片置于pH6.0的沸腾的10mmol/L的柠檬酸钠缓冲液中，并在沸点温度维持10min，冷却30min，双蒸水洗3次，每次3min；将切片放入30mL/L H2O2中室温下浸泡10min，PBS洗3次，每次3min消除内源性过氧化氢酶；加一滴封闭液（100mL/L山羊血清）于组织切片上，室温下孵育15min；弃去封闭液（不要冲洗）加稀释的一抗p-Akt（以1∶50的比例稀释一抗）于组织上，在湿盒中4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次3min，每张切片加一滴抗兔生物素化二抗，湿盒中37℃孵育15min； PBS洗3次，每次3min，每张切片加一滴HRP标记链亲和素，湿盒中37℃孵育15min；PBS洗3次，每次3min，每张切片加一滴DAB显色液，镜下控制反应时间；自来水充分冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化，稀氨水返蓝，脱水，透明，封片，镜检。阴性对照：以PBS代替一抗，余步骤同上。

    每只动物取4张切片，每张切片在高倍镜下（40祝┤?个视野（以视神经为基准分别向两侧各取两个视野）进行图像分析，取其平均值作为该动物的实验结果。免疫组化切片采用BI-2000 医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）进行分析，分别测量神经节细胞层（ganglion cell layer,GCL）、内网层（inner plexiform layer,IPL）和内核层（inner nuclear layer,INL）阳性表达的平均光密度。TUNEL和HE染色切片采用Image- proplus 图像分析软件（美国 Media Cybernatics公司）进行分析。TUNEL染色切片，分别测定每高倍视野中阳性细胞（细胞核染色显示棕黄色或棕褐色为TUNEL阳性细胞）所占的面积和该视野中整个视网膜所占的面积，计算凋亡指数（AI=阳性细胞面积/整个视网膜面积）。HE染色切片分别测定每高倍视野下视网膜内层厚度（视网膜内界膜至内核层外端的距离）和视网膜全层的厚度，计算视网膜内层厚度占视网膜全层的百分比（视网膜内层厚度占视网膜全层的百分比=视网膜内层厚度/视网膜全层厚度×100%）。

    统计学处理：结果采用均数±标准差表示。应用SPSS(13.0)统计学软件对结果进行统计学分析，采用析因设计的方差分析。P <0.05为差异有统计学意义。

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