2结果

    2.1视网膜光镜下形态学改变 正常组大鼠视网膜HE染色可见结构完整，层次清楚，细胞排列整齐；GCL大多呈单层排列，胞核大而染色淡，呈圆形或椭圆形，细胞边界清晰；IPL较厚，约为INL厚度的两倍，呈明显的网状结构；INL由4～6层细胞构成，排列整齐，胞核较大，染色稍深；外网层为疏松的网状结构，比IPL薄；外核层（outer nuclear layer,ONL）由9～12层细胞构成，胞核较小，染色深，排列较精密；外界膜整齐清楚；视锥、视杆层呈规则的毛刷状；色素上皮层可见排列整齐的单层视网膜色素上皮细胞。急性高眼压后生理盐水组视网膜结构疏松，细胞排列紊乱。神经节细胞数目减少，核染色质浓缩边聚、核膜及胞膜内陷、胞质染色较深；部分节细胞出现核溶解、核染色浅淡、胞质染色浅淡；有时可见核质边界不明显，细胞空泡化等坏死性改变；IPL结构疏松；INL细胞减少、变薄，细胞排列疏松紊乱。ONL及视锥、视杆层未出现明显的改变。rhEPO组视网膜神经节细胞形态大致正常，部分视网膜尚可见到上述变性改变，神经节细胞数目无明显减少；IPL及INL厚度与正常组无明显区别。ONL及视锥、视杆层未见异常。rhEPO组视网膜内层厚度所占百分比较生理盐水组增大，在24h和72h差异有统计学意义 (P <0.01，表1)。

    2.2 TUNEL原位细胞凋亡检测 正常组大鼠视网膜各层未见凋亡阳性细胞，生理盐水组在6h开始出现凋亡，主要发生GCL；24h与48h凋亡阳性细胞增多，主要见于GCL和INL，ONL偶见阳性细胞；72h凋亡阳性细胞减少。rhEPO组与生理盐水组相比，凋亡阳性细胞减少,AI减小（P <0.01），且在24h和48h AI差异有统计学意义（P <0.01，表1），但尚不能认为6h与72h AI差异有统计学意义（P >0.05，表1）。

    2.3 p-Akt免疫组化检测 正常组大鼠视网膜p-Akt有轻度表达。生理盐水组和rhEPO组大鼠视网膜p-Akt的表达较正常组增强，阳性细胞（细胞核呈现棕黄色染色）主要分布于视网膜的GCL、IPL和INL，并且同一视网膜组织中GCL和INL阳性细胞的表达强于IPL。rhEPO组与生理盐水组比较，p-Akt的表达增强（P <0.01）。在GCL(表2)，rhEPO组p-Akt的表达在6h(P <0.05)，48h和72h(P <0.01)与生理盐水组比较差异有统计学意义；在IPL(表2)，rhEPO组p-Akt的表达在6h（P <0.05），48h和72h(P <0.01)与生理盐水组比较差异有统计学意义；在INL（表2），rhEPO组p-Akt的表达在6h(P <0.05)，48h(P <0.01)与生理盐水组比较差异有统计学意义。

    3讨论

    青光眼是一组以视神经凹陷性萎缩和视野缺损为共同特征的疾病，病理性眼压增高是其主要危险因素，目前是全世界第二位的致盲性眼病。青光眼视神经萎缩和视野缺损的发生和发展与眼压升高程度和视神经对压力损害的耐受性有关。高眼压使视神经视网膜组织发生一系列变化，导致视功能发生不可逆性损害[2]。本青光眼动物模型的构建是以升高眼压为手段而达到实验性模拟青光眼视网膜视神经损害的目的，具体方法如前所述。此模型操作简单，容易控制，可以通过灌注液高度的变化造成不同程度的视网膜缺血，因此本方法早已被许多学者所接受，并应用于视网膜神经节细胞保护药物的研究上来。国内外学者通过在形态及功能方面大量的研究已证明此方法的可靠性和稳定性[5]。本实验结果显示：急性高眼压主要对大鼠视网膜内层造成损伤，使视网膜内层厚度所占全层百分比减少，神经节细胞层与内核层凋亡细胞增多，此结果与前人的研究结果一致。

    目前在控制眼压的基础上，给予视神经保护治疗被认为是青光眼最理想的治疗方式。传统上，EPO被视为对抗缺氧反应时，由胎儿肝脏和成人肾脏产生的促进红细胞生成的因子，并认为EPO作为一种大分子的糖蛋白，不能通过血脑屏障。但最近的研究结果显示：EPO在中枢神经系统发挥生理学作用。EPO和EPOR在中枢神经系统表达并在缺血、缺氧时表达上调，说明此因子是大脑对损伤反映的重要调节因子。有实验证实，外源性EPO预处理可保护培养的神经元免受缺氧、谷氨酸兴奋性毒性以及生长因子缺乏的损害；在缺氧、缺血性脑损伤、炎症以及外伤性脊髓损伤的动物模型中，全身使用EPO可穿过血脑屏障，发挥对神经元的保护作用[6]。这就为全身应用EPO发挥对神经系统的保护作用提供了实验依据。

    短暂的全视网膜缺血与短暂的全脑缺血有许多相似之处，都引起特异性的神经元选择性损伤：海马CA-1区的锥体神经元易受短暂性大脑缺血损伤；同样的，视网膜内核层神经元比外核层神经元对短暂性视网膜缺血更敏感，两种类型的损伤都与神经元的凋亡有关。另外，许多相同的信号传导通路在视网膜和大脑缺血时被激活[6]。考虑到两种类型神经元损伤的相似性，我们利用前房高压灌注法制造急性高眼压模型，通过腹腔注射rhEPO来研究其对损伤视网膜的保护作用，结果显示造模前3h通过腹腔注射rhEPO，减少并延缓了视网膜凋亡的发生，使视网膜内层厚度占全层的百分比增大，减弱了高眼压对视网膜的损伤，起到神经保护作用。

    细胞凋亡是细胞生命现象的基本特征之一，是细胞在基因指导下的主动死亡形式。在生理条件下，凋亡主要存在于机体的发育和衰老过程中；在创伤、炎症、缺血、理化因素刺激等病理条件下，也常可诱导凋亡的发生[7]。作为一种细胞自发性的主动死亡过程，凋亡也参与急性高眼压损伤后视网膜神经元的减少过程[1]。TUNEL技术基于凋亡细胞核DNA生化改变，由带标记物的三磷酸去氧鸟苷（deoxyuridine triphosphate,d-UTP）与DNA断端特异结合，其所标记的神经元细胞核，被认为是不再进行有丝分裂的神经元凋亡的特征[7]。我们利用TUNEL技术检测了急性高眼压大鼠视网膜神经元凋亡的情况，结果显示，生理盐水组在急性高眼压后6h出现凋亡细胞，主要位于GCL，24和48h凋亡细胞增多，GCL和INL均可见凋亡细胞，72h凋亡细胞有所减少；应用rhEPO后使各时间点大鼠视网膜的凋亡细胞减少，进一步证明视网膜神经元发生凋亡是导致急性高眼压损伤视网膜神经节细胞死亡的重要方式之一，外源性的rhEPO可以对高眼压损伤视网膜发挥保护作用。

    磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B(PKB或Akt)是近年发现的信号传递因子。PKB又称为Akt，是一个在许多的生物反应中起重要作用的丝/苏氨酸蛋白激酶。许多的肽类生长因子如胰岛素、类胰岛素生长因子等通过激活PI3K信号转导通路诱导Akt的激活，激活的Akt从胞浆转位至胞核内，参与细胞生存和凋亡的调节[8]。EPO是一个肽类细胞因子，能够通过其受体发挥作用,因此本实验观察rhEPO能否在视网膜急性高眼压损伤中激活PI3K/Akt通路来调节凋亡的发生。由于目前认为Akt是PI3K直接的下游底物，而且应用PI3K的抑制剂可以阻断Akt的激活[9]。因此我们检测磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）的表达，来推断PI3K/Akt通路的激活情况。我们发现，在正常组视网膜p-Akt有弱表达，生理盐水组在急性高眼压后6h有p-Akt的表达，主要表达于GCL，IPL和INL，24h表达增强，48及72h表达减弱；而rhEPO组在各时间段p-Akt的表达高于生理盐水组，且在6，48及72h差异有统计学意义(P <0.05)，说明rhEPO在高眼压视网膜损伤中上调了p-Akt的表达，并且结果显示，p-Akt的表达增强，细胞凋亡减少。因此可看出，Akt起着抗凋亡的作用，rhEPO通过激活PI3K/Akt信号传导通路减少了细胞凋亡，起到了神经保护作用。

    总之，本实验通过急性高眼压动物模型的建立，探讨rhEPO预处理对损伤视网膜的作用，得出以下结论：急性高眼压主要对视网膜神经节细胞层、内网层、内核层造成损伤，腹腔注射rhEPO可抑制视网膜内层萎缩，减少和延缓凋亡细胞的生成，其可能的机制是通过激活PI3K/Akt信号传导通路，上调p-Akt抑制凋亡的发生，从而发挥对视网膜的保护作用。本实验研究为临床应用rhEPO治疗青光眼以及其他视网膜视神经疾病提供了新的实验依据。

    【参考文献】

    1王宁利,魏文斌.北京同仁医院眼科专题讲座.郑州:郑州大学出版社,2005:87-90

    2惠延年.眼科学.北京:人民卫生出版社,2004:131-142

    3李美玉,蒋幼芹,王宁利.第三届国际青光眼会议及21世纪青光眼会议概况.中华眼科杂志,2002:38(1):60-62

    4 Juul S. Erythropoietin in the central nervous system,and its use to prevent hypoxic-ischemic brain damage, Acta Paediatr Suppl ,2002;91(438):36-42

    5赵秀军,徐亮,白凤阁.正常大鼠和急性高眼压诱导的视网膜缺血再灌注损伤大鼠模型的视网膜电图.眼科,2001;3(10):173-178

    6 Junk AK, Mammis A, Savitz SI, Singh M, Roth S, Malhotra S, Rosenbaum PS, Cerami A, Brines M, Rosenbaum DM. Erythropoietin administration protects retinal neurons from acute ischemica-reperfusion injury. PNAS ,2002;99(6):10659-10664

    7牛建军.重组人促红细胞生成素对大鼠视神经不完全损伤后视网膜神经元保护作用的研究(硕士学位论文).重庆:第三军医大学,2004

    8 Datta SR, Dudek H, Tao X, Masters S, Fu H, Gotoh Y, Greenberg ME. Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery. Cell ,1997;91:231-241

    9 Bernaudin M, Marti HH, Roussel S, Divoux D, Nouvelot A, Mackenzie ET, Petit E. A potential role for erythropoietin in focal permanent cerebral ischemia in mice. J Cereb Blood Flow Metab ,1999;19:643-651

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