作者：杨建华 ， 段俊国  

    作者单位：1（610500）中国四川省成都市，成都医学院第一附属医院眼科；2（610075）中国四川省成都市，成都中医药大学眼科

    【摘要】  目的：观察中药黄芪提取物对体外高糖培养牛视网膜毛细血管周细胞（pericyte,PC）的影响。

    方法：在体外高糖(20mmol/L)培养2d的第3代周细胞中加入不同浓度的黄芪提取物，继续培养2d，用MTT比色法，测定每组的吸光度值(A值)，根据A值计算抑制率。另在周细胞中加入0.4g/L黄芪提取物,2d后收集细胞,用流式细胞仪测定凋亡细胞百分率。

    结果：黄芪提取物0.0256~10 000mg/L浓度组对高糖培养周细胞的增殖有促进作用，其A值与空白对照组相比有显著性差异(P <0.05)。在周细胞以20mmol/ L 葡萄糖培养48h后,加入400mg/L黄芪提取物组的细胞凋亡百分率低于空白对照组和模型组(12.2%±1.5%vs 7.30%±2.0%，18.6%±2.1%P <0.05)。

    结论：黄芪能抑制周细胞凋亡，提高体外高糖培养视网膜毛细血管周细胞的存活力。

    【关键词】  中药提取物；视网膜毛细血管周细胞；糖尿病视网膜病变

    糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病所致微血管病变的主要并发症之一，随着细胞生物学和分子生物学在眼科领域的不断渗透，逐渐认识到视网膜毛细血管周细胞的选择性消失是DR最早期的病理改变之一，周细胞结构和功能的完整对维持视网膜毛细血管的稳定性具有十分重要的作用。高血糖是各型糖尿病的共同特征，高血糖可引起周细胞代谢途径发生变化，使其结构和功能发生改变，从而导致周细胞数量显著减少甚至消失。目前，对DR早期周细胞衰亡机制及其保护治疗研究已成为该领域内研究的热点。但周细胞保护药的种类和效果还很有限，有关药物的应用研究也不够理想。近年来研究的周细胞保护剂,如醛糖还原酶抑制剂、蛋白质非酶糖基化终末产物抑制剂、自由基清除剂等,虽可以从不同途径保护周细胞，但这些药物存在着不同程度的副作用或价格昂贵的缺点,限制了在临床的使用。通过体内实验观察到,我院研制的治疗DR的益气生津、滋养肝肾、通络明目中药复方优糖明颗粒（由黄芪等八味中药组成）对非增殖期DR具有保护周细胞、防止周细胞消失及基底膜增厚的作用[1]。针对中药复方优糖明颗粒中黄芪这味主药,我们在体外高糖培养牛视网膜毛细血管周细胞模型的基础上，通过测定细胞存活率、凋亡细胞百分率等客观指标，用以观察不同浓度中药黄芪提取物对体外高糖培养牛视网膜毛细血管周细胞存活的影响，为优糖明颗粒的临床研究和应用提供实验依据。

    1材料和方法

    1.1材料 牛视网膜毛细血管周细胞来源于1d龄小牛（由成都锦江生物制品厂提供），处死后10min以内摘取眼球。DMEM干粉、Ⅲ型胶原酶粉、胰蛋白酶（Gibco公司）；胎牛血清(fetal bovine seline,FBS)（杭州四季青公司）；小牛血清（华西生化制品厂）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Sigma公司）；二甲基亚砜（Sigma公司）；中药黄芪提取物由成都中医药大学药学院制备。牛视网膜毛细血管周细胞体外培养：参照Gillies等[2]的方法并加以改进，连续培养3代后获得较纯净的周细胞用于实验。

    1.2方法 取融合培养的周细胞（第 3代），2.5g/L胰蛋白酶消化后用含 200mL/L FBS的常规DMEM培养液配成 5×107/L密度的单细胞悬液，以每孔 200μL接种于3个 96孔培养板内，37℃, 50mL/L CO2培养箱内培养。24h后(细胞已贴壁)吸净DMEM培养液，每孔加入葡萄糖浓度为20mmol/L的DMEM培养液100μL继续培养2d后，分组加入不同浓度的各种黄芪提取物溶液100μL，并设加葡萄糖不加药物之模型组及只加DMEM培养液不加葡萄糖和药物的空白对照组。然后再置入37℃, 50mL/L CO2培养箱内培养，2d后取出96孔培养板，每孔加入 5g/L MTT溶液100μL 后继续培养4h后吸净孔内上清液，每孔加入2g/L二甲基亚砜（DMSO）150μL振荡5min，立即在酶联免疫仪上以590nm波长测定各孔吸光度值(A值)，并根据A值计算细胞增殖率。细胞增殖率=（试验组A 值-对照组A值）/(对照组A值)×100%。另取融合培养的周细胞（第 3代），胰蛋白酶消化后用常规DMEM培养液制成细胞悬液，调整细胞密度，以5×107/L的密度加入培养瓶，37℃，50mL/L CO2孵箱培养24h，细胞完全贴壁后，无血清培养液洗涤3次，随机分为3组（每组5瓶），空白对照组各瓶中加入葡萄糖浓度为5.5mmol/L的DMEM培养液5mL，模型组和实验组各瓶中加入葡萄糖浓度为20mmol/L的DMEM培养液5mL,放入37℃，50mL/L CO2孵箱培养48h后,吸尽各组培养瓶中液体, 空白对照组各瓶中重新加入葡萄糖浓度为5.5mmol/L的DMEM培养液5mL，模型组各瓶中重新加入葡萄糖浓度为20mmol/L的DMEM培养液5mL, 实验组各瓶中加入葡萄糖浓度为20mmol/L的DMEM培养液和400mg/L的黄芪提取物各2.5mL，放入37℃，50mL/L CO2孵箱培养48h。4h后吸净培养液，PBS液漂洗、胰蛋白酶消化、收集固定细胞、送检。

    2结果

    2.1黄芪对体外高糖培养牛视网膜毛细血管周细胞增殖的影响 20mmol/L葡萄糖可明显抑制视网膜周细胞的增殖，0.0256~10 000mg/L黄芪提取物对高糖所致周细胞增殖的抑制均有不同程度的保护作用（表1）。

    2.2黄芪对体外高糖培养牛视网膜毛细血管周细胞凋亡的影响 中药黄芪对体外高糖培养周细胞有保护作用，其细胞凋亡百分率(12.2%±1.5%)低于模型组(vs 18.6%±2.1%，P <0.05)、高于空白对照组（vs 7.3%±2.0%，P <0.05）。

    3讨论

    对DR发病机制的研究在近几年有很大进步，尤其是在对DR本质的看法上不同于以往。随着对DR认识的深入，DR的治疗也不断提出新的看法。糖尿病视网膜病变毛细血管周细胞的保护治疗是近几年研究的热点，但目前周细胞保护药的种类和效果还很有限，有关药物的应用研究也不够理想。明.戴思恭《秘传证治要决.三消》谓：“三消得之,气之实,血之虚也,久久不治,气尽虚,则无能为力矣。”指出了消渴发病除阴虚外,尚有气虚的存在，并学习一僧人专用黄芪饮（即黄芪六一汤：黄芪、甘草）加减治疗消渴的经验，把益气放在治疗的首位，对后世医家用补气法治疗消渴颇有影响。清.叶天士《临症指南医案.三消》指出: “三消一证,虽有上、中、下之分,其实不越阴亏阳亢,津涸热淫而已。”消渴一证多为肺燥阴虚,胃中热盛,进而肾阴不足、虚火上炎,热盛,迫津外渗,故见汗为尿,气津两伤,遂发消渴。而黄芪补益气阴,健脾胃,布津液,秘固精气而止汗缩泉,历来被医家选作消渴病的常用药。

    黄芪又名黄耆、戴椹、独椹、蜀脂等,为豆科植物蒙左黄芪和膜夹黄芪的根。现代药理学研究证明黄芪主要含黄芪多糖、黄芪皂甙、生物碱、葡萄糖醛酸及微量元素硒等[3]。黄芪具有促进机体代谢的作用，在细胞培养中可使活细胞数明显增多，细胞生长旺盛，寿命延长1倍左右[4]。黄芪多糖可使葡萄糖性高血糖或肾上腺素引起的血糖升高的血糖含量降低[5,6]。汪德清等[7]还发现黄芪总黄酮可降低细胞脂质过氧化物的生成,提高SOD细胞活性,维持细胞正常代谢。张家庆等[8]发现黄芪具有较强的抑制醛糖还原酶的作用。已有研究证实以黄芪为主要成分的优糖明颗粒对保护周细胞、防止周细胞消失及基底膜增厚确有疗效[1]。我们把视网膜毛细血管周细胞光密度值作为评价黄芪提取物对周细胞保护作用的客观指标。结果显示， 0.0256~10 000mg/L黄芪提取物对高糖所致周细胞增殖的抑制均有不同程度的保护作用，在浓度400mg/L时能显著抑制周细胞的凋亡（P <0.05）。这表明中药黄芪具有保护周细胞免受损害的作用，其作用机制可能为：黄芪有降糖和抑制醛糖还原酶活性的作用,其提取物可能有效改善糖尿病多元醇的紊乱，提高N+-K+-ATP酶的活性，改善周细胞的功能并减轻高血糖对肌醇摄取的竞争性抑制，促进周细胞摄取多肌醇；黄芪提取物可能减少细胞脂质过氧化物的生成,提高细胞清除氧自由基的能力,维持细胞正常代谢,减轻细胞内发生脂质过氧化反应及细胞膜的损害；黄芪提取物可能延长细胞寿命，使细胞代谢增强,推迟老化,促进DNA和蛋白质合成；近年来研究发现高血糖激活蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）信号传导通路过度激活是DR发生发展的一个重要原因。PKC的移位激活可促进多种细胞因子的表达，可使诱导型NO生成增加，还可抑制N+-K+-ATP酶的活性，最终导致细胞凋亡[9]。黄芪提取物可能具有较强的蛋白激酶C抑制作用,通过阻断PKC的途径而达到保护周细胞的作用。

    【参考文献】

    1叶河江.中药复方-优糖明治疗糖尿病性视网膜病变的实验研究.博士学位论文.成都:成都中医药大学,2001

    2 Gillies MC, Tao S. High glucose inhibits retinal capillary pericyte contractility in vitro. Invest Ophthalmic Vis Sci, 1993;34(2):3396-3399

    3刘汉丹,瞿佐发.黄芪的药理作用研究进展.现代中西医结合杂志,2002;18(9):1861-1862

    4翁维良,房书亭.临床中药学.郑州:河南科技出版社,1998:1420-1423

    5李先荣,马敬良.注射用黄芪多糖药理作用的研究-3.对血糖及其肝糖原含量的影响.中成药,1989;11(9):32-34

    6赵奎卿,贺经.黄芪对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的影响.国际眼科杂志,2006;6(5):1042-1044

    7汪德清,吴春之.黄芪总黄酮对羟自由基所致哺乳动物细胞损伤的防护作用.中国中医药杂志,1995;20(4):240-243

    8张家庆.糖尿病神经并发症的中药治疗.中华内分泌代谢杂志,1994;10(4):345-347

    9 King GL, Shiba T, Oliver J. Cellular and molecular abnormalities in the vascular endothelium of diabetes mellitus. Annul Rev Med ,1994;45(3):175-178