2 结果

　　2.1 荧光蛋白表达结果 hES腺病毒感染后，hRPE细胞形态正常，感染后8 h即开始出现GFP表达，24 h即可见全部hRPE细胞表达GFP，感染效率达到100%。GFP的表达在荧光显微镜490 nm波长激发光下呈黄绿色，弥漫于整个胞质中(见图1)。

　　2.2 免疫组化检测结果 免疫组织化学检测感染hES腺病毒后，hRPE细胞浆内可见棕黄色的阳性反应，在感染空载腺病毒的对照组中细胞胞浆无染色(见图2)。

　　2.3 RT-PCR检测结果 提取感染hES腺病毒的或空载腺病毒的hRPE细胞总RNA行RT-RCR反应，产物经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，可见hES腺病毒感染hRPE细胞总RNA样品中含有大小为623 bp左右的特异条带，而感染空载腺病毒的hRPE细胞未见条带(见图3)。

　　2.4 Western blot法检测结果 Western blot法观察到，hES腺病毒感染后，hRPE细胞培养上清液在分子大小约为20 kD处出现单一蛋白条带，感染空载腺病毒的对照组无特异条带出现(见图4)。

　　3 讨论

　　我们的前期实验表明，ES可以有效抑制氧致视网膜小鼠模型的视网膜新生血管的生成[4-5]，但由于蛋白治疗的缺点限制了其有效应用。基因治疗在理论上可以有效地克服蛋白用药的缺点，选择合适的载体和靶细胞，有可能实现ES在眼部细胞中的长期稳定表达，直接作用于眼底新生血管。并且由于眼球因血-眼屏障和全身循环相对独立，减少了作用于眼部的载体影响眼外器官的机会，使得其对全身的副作用最小，在眼局部的治疗效果最大，这是基因治疗眼部疾病的优势之一。基因治疗的基本组成元件是：载体(病毒载体、非病毒载体)、转导基因(外源基因)和靶细胞。因此，选择合适的载体和靶细胞，决定着基因治疗的成败。

　　目前，基因治疗常用的载体多为病毒载体，其中尤以腺病毒载体在临床和科研中应用最为广泛。腺病毒为双链DNA病毒，它的宿主范围广，临床前的研究表明，腺病毒载体DNA可以在肝脏、骨骼肌、心脏、脑、肺、胰腺和肿瘤组织中表达[5]，可感染分裂和非分裂终末细胞如神经元细胞，并且易于制备、纯化和浓缩，滴度高、感染效率高，以其为基因转移载体，可以制成胶囊或溶液。腺病毒DNA不整合受体细胞基因组，没有使抑癌基因失活和使原癌基因激活的潜在可能性，其控制转录复制单位E1基因和编码毒性产物E3基因已被剔除，因而不会自身复制，从而可以减少外源性基因可能产生的不良反应。腺病毒载体对人体致病性低，可以快速感染大多数人体细胞;另外，腺病毒载体可以携带较大的DNA片段。由此可见，与其他载体系统相比，腺病毒载体具有较强的优越性。所以本实验应用腺病毒构建的ES载体，并且携带有GFP标记，可以直接通过荧光显微镜观察感染是否成功。

　　基因治疗需要在体内有合适的靶细胞，那么眼内有哪些细胞可以作为基因转染的靶细胞?目前研究表明，视网膜色素上皮(RPE)细胞、视网膜血管内皮细胞、周皮细胞、Müller细胞均能作为转染的靶细胞。RPE置于缺氧状态下培养时，其血管内皮生长因子mRNA表达及蛋白合成分泌增加，缺氧RPE细胞条件培养液能显著刺激毛细血管内皮细胞增殖，提示RPE细胞在视网膜新生血管生成中起重要作用;另外，RPE细胞接受外源性基因的能力较强[6]，可以作为抗视网膜新生血管生成基因治疗的靶细胞。因此，本实验应用hRPE细胞作为靶细胞进行感染。

　　眼部新生血管的基因治疗研究已经证明，在动物模型中，应用腺病毒载体能有效表达色素上皮源性因子[7]。我们的前期研究表明，ES在氧致视网膜病变中能有效抑制新生血管的生成[4-5]。另外，ES在老年性黄斑变性患者的RPE细胞、Bruch膜及新生血管中有表达[8]，提示ES在眼内新生血管中起着重要的作用。我们构建的hES腺病毒表达载体已经证实能有效分泌ES蛋白[9]，因此将此载体应用到眼内靶细胞RPE中。

　　构建的hES腺病毒体外能否有效感染hRPE细胞是实验的关键步骤。通过预实验，我们发现当感染复数(MOI)为30时，体外感染的效果最好，MOI过低或过高均会影响到感染效率。本实验hES腺病毒体外感染hRPE细胞24 h以后，在荧光显微镜下可以看到几乎所有的hRPE细胞都被感染。提取细胞总RNA后进行RT-PCR检测，结果表明hRPE细胞中有ES mRNA的表达，这表明目的基因已经被腺病毒载体有效地导入hRPE细胞中。通过免疫组化反应，可以看到hRPE细胞胞浆里有强阳性反应，同时Western blot检测到培养上清液中有ES蛋白表达，这表明ES基因在hRPE细胞中能很好地表达出目的蛋白，并且分泌到了细胞外，这就为基因治疗眼底新生血管奠定了基础。

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