中华眼科杂志2000年第36卷第4期

　　陈凤华　陈翠真

　　摘　要　目的　观察牛磺酸对过氧化氢(H2O2)诱发牛晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用。方法　采用牛晶状体器官培养及DNA缺口末端原位标记法检测牛磺酸对H2O2诱发的牛晶状体上皮凋亡细胞数量的影响，并进行相关比较及统计学分析。结果　晶状体上皮细胞凋亡发生于晶状体混浊之前；牛磺酸可明显抑制H2O2所致的牛晶状体上皮细胞凋亡。结论　牛磺酸可抑制因氧化损伤诱发的牛晶状体上皮细胞凋亡，延缓和减轻白内障的发生和发展。

　　关键词：牛磺酸；过氧化氢；晶体；上皮细胞；凋亡

　　白内障的诱发因素较多，其中氧化损伤为主要原因，同时氧化损伤亦是细胞凋亡的诱发原因之一［1］；Forrest等［2］报道一种维生素E类抗氧化剂6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸（trolox）可抑制过氧化氢（H2O2）诱发的鼠胸腺细胞凋亡；近年有文献报道H2O2可诱发大鼠晶状体上皮细胞凋亡［3］。至今尚未见有关采用抗氧化剂抑制晶状体上皮细胞凋亡的报道。本实验以牛磺酸作为抗氧化剂，观察其对H2O2诱发的牛晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用。

　　材料和方法

　　一、取材

　　牛晶状体取自北京市肉联厂屠宰4h内的成年牛眼球。

　　二、主要试剂

　　末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）、链抗生物素蛋白-碱磷酶(SA-AP)、四氮唑盐(NBT)、溴氯代吲哚磷酸(BCIP)、无酚红DMEM培养基购自美国GIBCO-BRL公司；生物素-21-脱氧三磷酸尿苷（Bio-21-dUTP）购自美国Clontech公司；牛磺酸购自美国Sigma公司；甲醇、冰醋酸、盐酸购自北京化学试剂公司；均为分析纯试剂。

　　三、主要仪器

　　日本Olympus BH-2型显微镜；德国Heraeus公司CO2细胞培养箱。

　　四、实验方法

　　1.晶状体器官培养:洗净成年牛眼球血迹，剔除肌肉等组织，暴露干净的巩膜。用75%乙醇冲洗数秒钟后，用含庆大霉素32万U/L的PBS冲洗10min，再用含青霉素80万U/L、链霉素100万U/L的PBS冲洗10min。切开眼球，仔细取出晶状体，放于含青霉素20万U/L、链霉素25万U/L的无血清、无酚红DMEM培养基中培养8 h，弃除混浊的晶状体，挑选透明者用于实验。

　　2.分组:将上述透明晶状体随机分为3组，每组8个晶状体，将各组晶状体分别放入含有下列试剂的无菌培养皿中，于37℃、5% cO2培养箱中培养，对不同时间（3、24、48、72 h）混浊的晶状体摄像，进行观察比较。对照组：无血清、无酚红DMEM培养基；H2O2组：含5mmol/L h2O2的无血清、无酚红DMEM培养基；H2O2+牛磺酸组：含5mmol/L h2O2及4%牛磺酸的无血清、无酚红DMEM培养基。

　　3.晶状体上皮细胞凋亡的检测:采用DNA缺口末端原位标记（TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL）法检测上述3组培养3～72 h牛晶状体上皮细胞凋亡的情况。方法：分别将晶状体上皮细胞面向上铺于载玻片上，经PBS冲洗，用3∶1甲醇-冰醋酸固定15～30 min。PBS冲洗后，在65℃下温育1h。吸干PBS，加入TdT反应液50 μl，放入事先已温育到37℃的湿盒中，使含生物素的脱氧三磷酸尿苷（Bio-21-dUTP）标记在凋亡细胞的DNA缺口末端，1h后用终止缓冲液终止反应。PBS冲洗后加入已标记了碱性磷酸酶（简称碱磷酶）的链抗生物素蛋白（SA-AP）反应液100μl, 于37℃下温育15～30 min，进行抗原（Bio-21-dUTP）抗体（SA-AP）反应，使碱磷酶被标记在凋亡细胞的DNA缺口末端，再用碱磷酶反应底物液显色。通过上述处理，上皮组织中的凋亡细胞内存有特异性着染的蓝紫色颗粒，而正常细胞内无着色颗粒，在Olympus bH-2型显微镜下观察结果并照相。

　　五、统计学方法

　　使用SPSS 7.0软件包对数据进行处理；具体统计学方法包括单因素方差分析、配对t检验。

　　结果

　　本实验结果显示，随着H2O2作用时间的延长，晶状体的混浊程度逐渐加重。H2O2组72 h晶状体已完全混浊; H2O2+牛磺酸组晶状体混浊时间明显延迟（图1）。

　　图1　3组牛晶状体不同时间混浊程度的动态变化

　　对经H2O2作用不同时间的晶状体上皮细胞做TUNEL检测显示，培养3 h即可见晶状体上皮细胞凋亡，而晶状体混浊出现在培养6 h后，说明晶状体上皮细胞凋亡发生于晶状体混浊之前;晶状体混浊程度越重，晶状体上皮细胞凋亡的数目越多，凋亡细胞内蓝紫色颗粒的密度亦越大，72 h时整个细胞核几乎着染成蓝紫色（图2～6）。我们在400倍显微镜下分别对H2O2作用3、24、48和72 h 3组牛晶状体上皮组织中的TUNEL标记阳性细胞进行记数 （表1），每个视野记数200个细胞，每个标本随机选取5个视野，结果显示不同时间各组细胞凋亡平均发生率比较，差异有显著性（t=12.16，F=43.43，t=48.58，t=270.53，P＜0.01）；对作用24 h的H2O2组及H2O2+牛磺酸组的上皮细胞做TUNEL标记（图3，7）并进行比较，结果显示H2O2组细胞凋亡数量明显高于H2O2+牛磺酸组，差异有显著性（q=23.63，P＜0.01）。

　　表1　3组牛晶状体不同时间凋亡细胞的平均发生率

　　牛磺酸组 　 18.70±2.65* 　 　 检验值 t=12.16 F=43.43 t=48.59 t=270.53 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

　　*两数比较，q=23.63，P＜0.01

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