图2　H2O2组3 h牛晶状体混浊程度及上皮细胞形态　TUNEL×400

　　图3　H2O2组24 h牛晶状体混浊程度及上皮细胞形态TUNEL×400

　　图4　H2O2组48 h牛晶状体混浊程度及上皮细胞形态　TUNEL×400

　　图5　H2O2组72 h牛晶状体混浊程度及上皮细胞形态　TUNEL×400

　　图6　对照组72 h牛晶状体混浊程度及上皮细胞形态　TUNEL×400

　　图7　H2O2+牛磺酸组24 h牛晶状体混浊程度及上皮细胞形态　TUNEL×400

　　讨论

　　一、氧化损伤与白内障

　　目前医学界认为氧化损伤是诱发白内障的主要因素［4］。研究发现在正常及白内障眼的晶状体及房水中均存在一定量的过氧化氢，但白内障眼内的含量较正常人高［5］。氧化损伤使晶状体上皮细胞蛋白质结构改变、某些关键酶失活、DNA断裂及脂质过氧化［6］。正常情况下晶状体中含有抗氧化物质，保护晶状体免受氧化损伤。但在某些情况下，如体内氧化物质产生过多或晶状体清除这些物质的能力下降，晶状体将受到损伤。

　　实验证明超氧歧化酶、还原型谷胱甘肽及维生素E等均可抑制或延缓氧化损伤所诱发白内障的发生及发展［7］。牛磺酸是一种磺基氨基酸，在人体中大量存在；其具有抗氧化作用，能保护细胞和组织免受氧化损伤［8］。晶状体具有蓄积牛磺酸的能力，在晶状体中牛磺酸约占非蛋白质水解氨基酸的50%，是晶状体中重要的氨基酸；随着白内障病程的发展，晶状体中牛磺酸的含量显著降低［9］；本实验室近年来进行的一系列系统研究发现，牛磺酸对亚硒酸钠性白内障的抑制作用与其抗氧化特性有关［10］。

　　二、氧化损伤与细胞凋亡

　　随着对细胞凋亡与疾病关系的深入研究，人们发现氧化损伤也是诱发细胞凋亡的原因之一［1］。Li等［3］用H2O2诱使器官培养的鼠晶状体发生白内障,在其晶状体上皮组织中发现凋亡细胞。但目前尚未见采用抗氧化剂抑制晶状体上皮细胞凋亡的报道。

　　三、实验意义

　　本研究为探讨细胞凋亡是否为H2O2诱发牛晶状体混浊的早期表现；牛磺酸能否干预H2O2所致的晶状体混浊及阻止细胞凋亡，设计了上述实验，即牛磺酸能否保护晶状体上皮细胞免受H2O2损伤，延缓白内障形成（图1）；H2O2诱发牛晶状体混浊与相应培养时间晶状体细胞凋亡的相关性（图2～6）；以H2O2+牛磺酸组与H2O2组牛晶状体各培养24 h为例，评估牛磺酸对牛晶状体混浊及细胞凋亡的干预作用（图3，7）。

　　本实验结果表明，牛磺酸作为抗氧化剂可明显抑制H2O2诱发的牛晶状体上皮细胞凋亡，延缓和减轻晶状体混浊。随着H2O2作用时间的延长，晶状体混浊逐渐加重，晶状体上皮细胞凋亡的程度加重。值得注意的是，培养3 h即可检测到细胞凋亡，而培养6 h后才出现晶状体混浊，说明在晶状体混浊之前已发生了晶状体上皮细胞的凋亡。培养24 h后，H2O2组的凋亡细胞平均发生率显著高于H2O2+牛磺酸组，提示牛磺酸可明显抑制氧化损伤所致的晶状体上皮细胞凋亡。

　　四、有关实验设计

　　本实验采用TUNEL法检测凋亡细胞，主要是借助于TdT，将标记的脱氧三磷酸尿苷（dUTP）连接在降解的DNA片段3′端上。细胞凋亡时，早期即出现单链或双链DNA在核小体连接处断裂，最终形成180～200 bp的整倍数片段及游离的3′端，杂交特异性较强。预实验表明，阴性对照细胞未被明显标记；反之，已知存在DNA片段的标本则表现为阳性。此外，H2O2组标本如采用PBS代替Bio-21-dUTP，则不能显示细胞凋亡。各组实验同步严格操作中均无外来DNA污染，故本实验结果可排除假阳性干扰。在我们采用DNA片段进行分析的其他研究中，亦进一步证实了该方法的可行性。

　　志谢　北京医科大学人民医院中心实验室王申五教授

　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(39770786)

　　作者单位:陈凤华（首都医科大学,100054)

　　陈翠真(100005 北京市眼科研究所)

　　参考文献

　　1.陈凤华. 细胞凋亡与白内障研究.国外医学眼科学分册，1997,21：168-172.

　　2.Forrest VJ, Kang YH, McClain DE, et al . Oxidative stress-induced apoptosis prevented by trolox . Free Radic Biol Med, 1994,16:675-684.

　　3.Li WC , Kuszak JR, Dunn K, et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. J Cell Biol, 1995,130:169-181.

　　4.Spector A. Oxidative stress-induced cataract: mechanism of action . FASEB J, 1995,9:1173-1182.

　　5.Bhuyan DK, Camras CB, Lakhani HK, et al. Peroxide concentration in normal and cataractous human lenses. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1992,33:798.

　　6.Spector A,Wang GM, Wang RR, et al. The prevention of cataract caused by oxidative stress in cultured rat lenses. Curr Eye Res, 1993,12:163-179.

　　7.李根林. 抗氧化剂等治疗白内障的机理及疗效.国外医学眼科学分册， 1992,16：110-114.

　　8.Nakamori K, Koyama I,Nakamura T , et al. Quantitative evaluation of the effectiveness of taurine in protecting of ocular surface against oxidant. Chem pharm Bull, 1993,41:335-338.

　　9.Kasuya M, Itoi M,Kobayashi S, et al. Changes of glutathione and taurine concentrations in lenses of rat eyes induced by galactose-cataract formation or ageing. Exp Eye Res , 1992,54:49-53.

　　10.张伟，陈翠真.牛磺酸对亚硒酸钠性白内障抑制作用的实验研究.中华眼科杂志，1998,34：208-210.

上一页  [1] [2]