作者：李英俊 金龙山
ABSTRACT:OBJECTIVETo study the expression of transforming growth factorβ1(TGFβ1) and nuclear factorκB (NFκB) on conjunctiva endepidermis cells in patients with diabetes mellitus (DM).METHODS92 patients of DM and 70 cases of health adult were randomly selected. One eye in patients was selected to do the tear film breakup time (BUT), Schirmer test and cornea fluorescein staining, and the expression of NFκB and TGFβ1 on bulbar conjunctiva endepidermis was detected by immunohistochemistry.RESULTSThe ratios of BUT value (＜10s) and Schirmer value (＜5mm) in DM increased significantly as compared with the control group, and the degree of cornea fluorescein staining in DM was higher than that in control group. The staining level of NFκB and TGFβ1 of bulbar conjunctiva endepidermis in DM was higher than that in control group and was positive correlation. CONCLUSIONIn type 2 DM, the value of BUT and Schirmer decrease and the degree of cornea fluorescein staining increase is incident to the xeroma.
Key words: diabetes mellitus, type 2; transforming growth factor beta ;xerophthalmia
干眼症患者结膜上皮细胞内各种炎性因子的表达水平明显高于正常人，如表皮生长因子、转化生长因子β1 (transforming growth factorβ1，TGFβ1）及核转录因子κB（nuclear factorκB，NFκB）等［1,2］.TGFβ1是多功能细胞因子，对上皮细胞具有较明显的抑制作用，对成纤维细胞及其他间叶组织来源的细胞均具有明显的刺激作用，表现为胶原合成增加，有利于组织修复及伤口愈合［3，4］.NFκB是具有转录激活功能的蛋白质，几乎存在于所有细胞中,它可调节多种参与炎症反应的细胞因子、黏附分子和蛋白酶类的基因转录过程，与炎症的发生密切相关［5］.本研究采用免疫组织化学方法对2型糖尿病患者结膜上皮细胞中TGFβ1和NFκB的表达情况进行了检测，并比较分析了正常人群和2型糖尿病患者的眼表状态.
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验对象 本研究对象2型糖尿病患者和正常健康人共为162人，其中正常对照组为70人（70眼）、2型糖尿病组为92例（92眼），两组研究对象年龄及性别构成比间无显著性差异,具有可比性.
1.1.2 试剂 TGFβ1多克隆抗体，经亲和层析纯化的兔抗人IgG多克隆抗体，稀释度为1∶200；NFκB p65多克隆抗体，经亲和层析纯化的兔抗人IgG多克隆抗体，稀释度为1∶200.SP试剂盒(通用型SP kit)及DAB显色剂均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；PBS及Mayer苏木素均为福建迈新公司产品.
1.1.3 仪器 CMIAS系列真彩色病理图像分析系统为北京航空航天大学产品，RM2135型石蜡切片机为德国产品，CD1型快速生物医学微波炉为上海创大科技有限公司产品.
1.2 方法
1.2.1 临床检查 BUT重复测定3次，取平均值，BUT值小于10s判定为异常，基础泪液分泌试验以湿润长度小于5mm时判定为异常.角膜荧光素染色评分方法将角膜分为4个象限：0级为无染色（-），1级为散状点状染色（+），2级为密集型点状染色（），3级为片状染色（）.
1.2.2 免疫组织化学染色 将乙酸纤维素薄膜剪成3mm×3mm大小纸条，用培养皿包装进行消毒，预备贴有5mm×5mm大小双面胶的载玻片.取材时，嘱患者注视鼻侧，用眼科无齿镊夹住乙酸纤维素薄膜一角轻轻置于患者颞侧球结膜表面，用玻璃棒轻压少许后取出，贴于载玻片上，每个对象至少取2次标本，待薄膜稍干后，用950mL/L乙醇固定5min，置于-80℃超低温冰箱保存备用.进行免疫组织化学染色，检测TGFβ1及NFκB的表达情况.采用过氧化物酶标记的链霉菌抗生物素蛋白行免疫组织化学染色，阴性对照以PBS代替一抗进行，阳性对照为乳腺癌标本.染色结果判定标准：用光学显微镜观察，见细胞膜边界清晰，无特异性细胞膜或胞浆染色者为阴性(-)；细胞膜或胞浆有特异性着色，呈浅棕黄色、棕色及深棕色者分别为弱阳性(+)、中度阳性()及强阳性().将表达阴性和弱阳性者纳入阴性组，中度阳性和强阳性者纳入阳性组.
1.2.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，两组间BUT 检查、基础泪液分泌试验、角膜荧光素染色比较及糖尿病组TGFβ和NFκB表达相关性分析采用χ2检验进行.TGFβ1和NFκB表达与各项临床检查之间的相关性分析采用Spearman’s检验进行.
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