作者：龙艳 魏小勇 詹宇坚 李熙灿 徐传磊 徐勤
【摘要】【目的】探讨金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)总生物碱和粗多糖对白内障的抑制作用。 【方法】采用溶剂法分离提取金钗石斛总生物碱和粗多糖；体外培养大鼠晶状体,加入H2O2与总生物碱（或粗多糖）共培养24h；分别在培养后6、12、18、24h共4个时段于解剖显微镜下观察并记录晶状体混浊度的改变；检测晶状体水溶性蛋白、谷胱甘肽（GSH）的含量及总超氧化物歧化酶（TSOD）和丙二醛（MDA）的活性。 【结果】金钗石斛总生物碱和粗多糖均能减轻晶状体混浊度，并能显著升高晶状体水溶性蛋白、GSH含量及TSOD活性，降低MDA的活性（均Ｐ＜０.０５），其中石斛总生物碱高剂量组效果最佳。 【结论】金钗石斛总生物碱和粗多糖在体外均有一定的抗白内障作用，其机制与拮抗晶状体的氧化损伤有关，而总生物碱的效果优于粗多糖。
【关键词】 金钗石斛/药理学 金钗石斛/化学 白内障/中药疗法 晶状体 /病理学 器官培养
白内障(cataract)是一种常见的致盲眼病，它是多种因素共同作用的结果，氧化损伤是其发病机制之一［1］。当前许多中药研究都是从提高晶状体抗氧化能力入手，利用抗氧化剂或抗氧化酶激活剂来消除或中和晶状体中的氧化产物，阻止或逆转晶状体变浑浊，从而抑制或延缓白内障的发生发展［2］。石斛是一种名贵中药材，抗白内障是其主治功效之一。已有研究证实，石斛水煎剂可通过改变晶状体相关酶的活性而对D半乳糖性白内障起到防治作用［3］，石斛的乙酸乙酯提取物在体外还可抑制醛糖还原酶和过氧化脂质（LPO）的产生［4］，这些研究在一定程度上揭示了石斛抗白内障的作用机理。然而，石斛化学成分复杂，其抗白内障的具体有效成分是什么，至今仍未见报道。本实验通过体外培养晶状体，对金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)的粗提物总生物碱（total alkaloids）和粗多糖（polysaccharides）抗白内障作用进行了探讨，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 动物 4～5周龄Wistar大鼠20只,体质量80～120g，雌雄不限，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：粤临证字2007A025。
1.2 药材和试剂 金钗石斛由贵州赤水信天石斛有限公司提供，经广州中医药大学中药鉴定教研室李薇教授鉴定。DMEM低糖培养基（杭州吉诺生物医药技术有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS，福州迈新生物技术开发公司）；体积分数30%过氧化氢（H2O2，浙江临安化工二厂）；吡诺克辛钠滴眼液（武汉天天明药业有限责任公司，批号：070102）；Bradford蛋白质定量试剂盒（上海申能博彩生物科技有限公司）；谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；其他试剂均为国产分析纯。
试剂配制如下。改良碘化铋钾试剂：甲液：0.85g次硝酸铋溶于10mL冰醋酸，加水40mL;乙液：8g碘化钾溶于20mL水中；将甲液与乙液等量混合后，取1mL与2mL醋酸混合，供生物碱的显色用。Molish试剂：甲液：α萘酚1g，加体积分数75%乙醇至10mL；乙液：浓硫酸；供多糖的检测用。
1.3 仪器 E52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZDIII型循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；BS110S型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；HI98128型pH计（北京HANNA）；SWCJIF型超净台（苏州净化设备厂）；Galaxys型CO2培养箱（美国RS Biotech）；STPT型解剖显微镜（日本OLYMPUS）；5810R型低温高速离心机（德国Eppendorf ）；7200型分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）。
1.4 金钗石斛总生物碱和粗多糖的分离提取及检识 金钗石斛总生物碱和粗多糖的提取方法参照文献［5-6］并略加改进：干燥金钗石斛切碎打成粗粉，加入体积分数为95%乙醇85℃回流提取（4h/次×3次），合并提取液，减压回收乙醇后得到石斛浸膏，加1moL/L HCL调节浸膏的pH为3，氯仿萃取3遍后，弃氯仿层，加浓氨水调母液pH=11，再经氯仿萃取3遍，将氯仿层合并，减压浓缩，挥干氯仿后即得到总生物碱。将醇提后的药渣晒干后加入20倍体积的水，100℃回流提取（2.5h/次×4次），合并提取液，减压浓缩至一定容积后，加入体积分数95%乙醇，直至醇浓度为70%，置于冰箱内，隔夜取出沉淀用无水乙醇和丙酮各洗涤3遍，再经Sevag法除蛋白处理，冷冻干燥，得到粗多糖。总生物碱的检识参照文献［7］：取少量分离所得的总生物碱于试管内，加入蒸馏水和10μL二甲基亚砜（DMSO）将其充分溶解，滴在硅胶板上，喷雾改良碘化铋钾试剂后，可见硅胶板上滴了提取物溶液的点显现出非常明显的桔红色斑点，由此证明提取物为生物碱。粗多糖的检识参照文献［7］：取多糖水溶液1mL加入Molish试剂3滴，摇匀，倾斜试管，沿试管壁缓慢滴加1mL浓硫酸，静置,可见在试液与浓硫酸交界面产生非常明显的紫色环，证明提取物为多糖。
1.5 药物配制 用PBS分别将总生物碱和粗多糖配制成浓度为50mg/mL的溶液（生物碱加10μL DMSO助溶），0.22μm微孔滤膜过滤灭菌处理后-20℃保存待用。
1.6 晶状体的培养及分组 参照文献［8］的方法并略加改进：颈椎脱臼处死大鼠，用眼科剪镊迅速摘取双眼眼球，以含800U/mL青霉素、800μg/mL链霉素的冷PBS液漂洗眼球后，投入含相同浓度双抗液的PBS液中浸泡，转入超净台。约10min后将大鼠眼球转移至含500U/mL青霉素、500μg/mL链霉素的DMEM培养液中，小心从眼球后极部剪开巩膜，取出晶状体，去除晶状体表面的虹膜和玻璃体，晶状体经PBS液漂洗2遍后，再用DMEM液漂洗1遍，然后再放入已预热的24孔组织培养板中培养，每孔含1mL DMEM培养基（含体积分数20%胎牛血清、100 μ/mL青霉素、100 μg/mL链霉素），预培养5h(37.0℃、体积分数5%CO2)后，剔除受损伤或已混浊的晶状体。将35只未受损伤、透明的晶状体按照随机原则分7个组培养，每组5只：正常对照组（DMEM培养基+100μL胎牛血清），模型组（正常对照组培养基+2mmol/L H2O2），生物碱高、低剂量组（正常对照组培养基中各加入2mmol/L的H2O2，同时分别添加4、2mg/mL生物碱），多糖高、低剂量组（在正常组培养基中各加入2mmol/L的H2O2，同时分别添加4、2mg/mL粗多糖），阳性对照组（正常对照组培养基+2mmoL/L的H2O2+100μL吡诺克辛钠滴眼液）。上述各组培养基均含100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素。
1.7 观察并照相记录晶状体混浊度 加药培养后，每6h更换1次培养液以保持H2O2浓度不变。同时观察并记录各组晶状体混浊度。离体培养晶状体混浊度的分级方法参照文献［9］：在黑色背景下设计1mm×1mm的黑色方格图，将被检晶状体置于"+"字交叉的黑色线条之上，在解剖显微镜下观察晶状体，按透过晶状体所能看到的线条清晰度进行分级。"-"表示线条清晰可见，为完全透明；晶状体"+"混浊：线条模糊，但轮廓尚可辨；"++"混浊：线条轮廓不清，仅中央部隐约可见；"+++"混浊：线条完全不见，晶状体全部混浊。最后以各组晶状体混浊度，即"+"出现量的多少进行统计学处理。培养后24h，给各只晶状体拍照。
1.8 晶状体水溶性蛋白GSH含量及SOD、MDA活性检测 晶状体拍照后，用冷PBS液洗涤2遍，尽量洗净培养液，再用滤纸吸干水分，称质量。按质量与体积比为1∶10的量加入冷PBS液，在冰浴上充分匀浆后倒入2mL离心管中，4℃、12000r/min离心20min，取上清即为晶状体水溶性蛋白，采用Bradford法检测定蛋白含量。取剩余上清，分别采用二硫代二硝基苯甲酸法检测GSH含量，采用黄嘌呤氧化酶法测定总超氧化物歧化酶（TSOD）活性，采用硫代巴比妥酸（thibabituric acid,TBA）法检测MDA活性，以上操作方法均严格按照试剂盒说明书进行。
1.9 统计学方法 应用统计软件SPSS 11.5对所有数据进行统计分析。
2 结果
2.1 各组药物对晶状体混浊度的影响 晶状体分组培养后6h，模型组晶状体均出现"+"度浑浊，其他各组均透明；继续培养6h，可见正常对照组晶状体均保持透明，模型组晶状体为"++"～"+++"度混浊，其他各组晶状体混浊度在"+"～"++"度不等；培养后24h，正常对照组晶状体均保持透明，模型组晶状体均为"+++"度混浊，肉眼观为乳白色，且晶状体体积明显缩小，其他各组晶状体混浊度表现为"+"～"+++"不等。各个药物添加组中，阳性对照组、生物碱高剂量组晶状体混浊度较模型组显著减轻（均P＜0.05）；生物碱高、低剂量组及粗多糖高、低剂量组晶状体混浊度与阳性对照组比较均无显著性差异（P＞0.05 ）。将各组晶状体混浊度与过氧化氢损伤的时间进行相关性分析，其中生物碱高剂量组差异有显著性意义（P＜0.01 ），其他各组差异也均有显著性意义（P＜0.05 ），由此可见，随H2O2作用时间的延长，晶状体混浊度逐渐加重。结果见表1及图1。
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