反义PCNA与反义bcl-2脱氧寡核苷酸抑制人视网膜色素上皮生长
第四军医大学学报2000年第21卷第2期
王琳 惠延年 王雨生 惠宏襄 金明
摘 要: 目的 观察反义增生细胞核抗原(PCNA)和反义bcl-2脱氧寡核苷酸对培养的人视网膜色素上皮细胞(RPE)生长的作用.方法 用DNA合成仪合成有18个核苷酸的反义PCNA和15个核苷酸的反义bcl-2脱氧寡核苷酸片段，以不同浓度加入RPE培养液，培养2～4 d, 用SABC法检测细胞PCNA和bcl-2的表达，用MTT法及流式细胞仪测定细胞抑制率.结果 6.25～100 μmol·L-1的反义PCNA对RPE的抑制率为8.3%～38.4%,呈剂量依赖性，并抑制细胞PCNA的表达. 反义bcl-2未显示抑制作用.结论 反义PCNA脱氧寡核苷酸可抑制近40%的RPE生长，其临床应用值得进一步研究.
关键词：色素上皮/眼；PCNA；bcl-2；反义脱氧寡核苷酸
0 引言
对RPE生长的抑制已成为增生性玻璃体视网膜病变(PVR)辅助治疗和预防的重要措施.类固醇和抗代谢药的临床疗效尚未肯定［1,2］.抑制所有细胞必须的过程如微管转运或RNA,DNA合成的药物都有潜在的毒性［3］.而用生物疗法包括基因治疗可能从分子水平调控或抑制细胞生长.反义核酸技术是最具潜力的基因疗法之一，利用人工合成的寡核苷酸片段有选择地封闭某种基因，可抑制细胞增生，且少有细胞毒性［4］.寡核苷酸(PCNA)是DNA复制的一种重要蛋白，在培养的人RPE中有较高的表达［5］.反义PCNA可能抑制RPE增生. Bcl-2有抗凋亡作用，与细胞生长不无关系［6］.为观察反义ODN对RPE的作用，进行了本实验.
1 材料和方法
1.1 材料 人RPE的培养和鉴定同以往的报告［7］.合成的反义PCNA的核苷酸序列为: 5′ TTCGAGGCGCGCCTGGTC 3′.该序列与PCNA基因mRNA的起始码及其后的5个三联码互补.采用亚磷酰胺DNA合成法，在固相硅胶上按 3′→5′方向合成，并进行硫代修饰.合成的反义bcl-2的核苷酸序列为: 5′CCCAGCGTGCGCCAT 3′.此序列与bcl-2基因mRNA的起始位点及其后的4个三联码互补.合成方法与合成反义PCNA片段相同，亦经硫代修饰.
1.2 方法 反义寡核苷酸对RPE的PCNA和bcl-2表达的影响,将6～10次传代的RPE悬液以1.5×107．L-1的密度接种于置有18mm盖玻片的6孔培养板中，每孔2mL，同时加入100μmol．L-1的反义PCNA或反义bcl-2，于接种后48h取出细胞片，终止培养.用PBS浸洗细胞片，冰丙酮固定. 抗PCNA和抗bcl-2免疫细胞化学染色,采用SABC染色法［5］. 染色结果的图像分析,采用真彩色图像分析仪，每张细胞片于高倍(×200)显微镜下随机选取30～35个阳性细胞进行测量分析，得出目标积分光密度，每组3张片，然后进行t检验.
MTT比色法测定反义PCNA对RPE增生的作用采用传代6～10次的细胞,调整至1×107．L-1，接种至96孔培养板中，每孔0.2 mL，置于CO2孵箱，孵育24 h后更换5 g．L-1 nBS的DMEM液，同时加入反义PCNA和无关序列的核苷酸片段，使其终浓度分别为6.25,12.5,25,50和100μmol．L-1，继续培养，每天换液1次，并加相应浓度的反义核酸，至48 h,3 d和4 d时，采用MTT法测定A值. 计算反义核酸对RPE生长的抑制率，并作统计学处理.每组平行6孔. 实验重复2次. 反义核酸片段对细胞周期的影响:将密度为1×107．L-1的细胞接种于80 mL培养瓶，孵育24 h后更换50 mL．L-1NBS的DMEM培养液，同时分别加入反义PCNA和反义bcl-2核苷酸片段，终浓度为100μmol．L-1；再培养24 h时又加入反义核酸1次，继续培养共48 h. 制成单个细胞悬液，按常规做流式细胞仪测定.
2 结果
2.1 反义寡核苷酸对RPE的PCNA和bcl-2表达的影响 反义PCNA作用48 h后，RPE的PCNA染色减弱. 细胞图像分析显示对照组的细胞积分A值为28±4，处理组的为20±1下降29%(P＜0.05).反义bcl-2作用48 h后，bcl-2染色强度无明显改变，图像分析结果对照组的积分A为83±4，处理组为80±2(P＞0.05).
2.2 MTT比色法检测反义PCNA对RPE增生的作用 A值在细胞数为1×103～1.5×104个范围内呈线性相关(r=0.98，P＜0.05).反义PCNA作用后的不同时间内，各浓度组的A值逐渐下降.从低到高5种浓度(6.25,12.5,25,50和100 μmol．L-1)的反义PCNA对RPE生长的抑制率，在2 d时依次分别为8.3％,13.6％,20.6％,23.3%和28.8%；3 d时，抑制率依次分别为12.1%,18.1％,24.5％,27.5％和34.4％；4 d时的抑制率依次分别为17.1％,24.5％,30.3％,33.3％和38.4％.抑制作用呈浓度依赖性(P＜0.05).无关对照序列对细胞生长无抑制作用. 100 μmol．L-1的反义PCNA作用4 d时，细胞生长较慢，细胞密度较对照组密度明显减少，而细胞形态未见明显影响，无细胞脱离.台盼蓝染色显示处理组与对照组的细胞存活率均达94％，表明对细胞无明显毒性.
2.3 反义核苷酸片段对细胞周期的作用 流式细胞仪测定分析结果,100 μmol．L-1浓度的反义PCNA作用于细胞48 h后，RPE的G1期细胞增加了10%，S期细胞减少40%，S+G2+M期细胞减少24%.反义bcl-2作用后细胞周期无明显改变.
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