3 讨论
反义寡聚脱氧核苷酸具有与靶基因的mRNA互补的序列,可调控细胞的增生和细胞表型,是反义核酸技术中最简单有效的方法[4].我们选择了mRNA的启动子部位作为反义PCNA和反义bcl-2片段的作用部位[8],前者的长度为18 mer,后者为15 mer,这样既可有效作用,也可减少因片段过长引起非特异性杂交作用[4]. pCNA是一种有丝分裂信号中的最终通路的细胞内因子.它是正常的和肿瘤细胞的DNA复制的关键.我们假设用反义核酸下调PCNA的表达可能有助于抑制RPE的增生.文献中尚未见对RPE生长作用的报告.
检测靶基因在细胞中的表达状态,是判断反义核酸效果的重要指标.实验表明,2 d时经反义PCNA作用的RPE的PCNA表达呈有意义地下降,图像分析测定值减少了近30%,这表明细胞的PCNA合成受到抑制.因为缺乏可比性, 这一数值的意义尚难判定. 不过,培养的人RPE细胞在生长中是非同步化的细胞,我们测定的PCNA蛋白表达率在传代培养12~48 h最高为50%,这与Celis等[9]报告的未经同步化处理的羊膜细胞的PCNA表达阳性率为42%相似.因此可以推测,即使是有效的抑制,反义核酸作用后的蛋白表达率也不会高于这一数值,近30%的下调可以认为是有效的抑制了PCNA的表达.
实验结果还表明,反义PCNA可抑制RPE生长,在6.25 μmol.L-1浓度,作用3 d即可抑制细胞的增生,这种抑制作用随反义片段的浓度加大而增强,呈剂量依赖性.细胞周期也发生变化,S期DNA含量下降,G1期增加.细胞周期的改变与Jaskulski等[8]的报告一致. 他用18 mer的反义PCNA抑制经同步化处理的、鼠3T3细胞的生长,抑制率达47%;S期DNA含量降低,表明PCNA反义寡核苷酸的阻断作用发生在G1/S交界区或S早期.我们的结果显示,反义PCNA对RPE增生的最大抑制率为38.8%.反义核酸对细胞生长的抑制率与细胞是否同步化及生长活性等有关,对同步化细胞和肿瘤细胞的抑制率通常会较高些[8]. rPE为非同步化细胞,PCNA蛋白表达率最高为50%左右,细胞周期分析显示RPE的S期DNA含量为28.3%. rPE不是肿瘤细胞,只是可以恢复生长活性的一种非终末细胞,在实验条件下用单一血清培养时,RPE的增殖速率和DNA合成水平较低,因此反义核酸对其的抑制是有限的.但在临床作为手术后或防治PVR的一种辅助方法,有进一步研究的价值.
本实验没有显示反义核酸片段对RPE的bcl-2表达和细胞生长有明显作用,也未观察到对RPE的凋亡诱导作用. 我们推测,bcl-2在培养的RPE处于低水平表达[5]等因素与此有关.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39470742)
作者简介:王琳(1965-),女(汉族),山东省蓬莱县人.博士,讲师,主治医师. 发表论文20篇. Tel.(029)3373480王琳(第四军医大学 西京医院眼科) 惠延年(第四军医大学 西京医院眼科)
王雨生(第四军医大学 西京医院眼科)
惠宏襄(基础部生物化学教研室,陕西 西安 710033)
金明(基础部生物化学教研室,陕西 西安 710033)
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