3　讨论

　　反义寡聚脱氧核苷酸具有与靶基因的mRNA互补的序列，可调控细胞的增生和细胞表型,是反义核酸技术中最简单有效的方法［4］.我们选择了mRNA的启动子部位作为反义PCNA和反义bcl-2片段的作用部位［8］，前者的长度为18 mer，后者为15 mer，这样既可有效作用，也可减少因片段过长引起非特异性杂交作用［4］. pCNA是一种有丝分裂信号中的最终通路的细胞内因子.它是正常的和肿瘤细胞的DNA复制的关键.我们假设用反义核酸下调PCNA的表达可能有助于抑制RPE的增生.文献中尚未见对RPE生长作用的报告.

　　检测靶基因在细胞中的表达状态，是判断反义核酸效果的重要指标.实验表明，2 d时经反义PCNA作用的RPE的PCNA表达呈有意义地下降，图像分析测定值减少了近30%，这表明细胞的PCNA合成受到抑制.因为缺乏可比性, 这一数值的意义尚难判定. 不过，培养的人RPE细胞在生长中是非同步化的细胞，我们测定的PCNA蛋白表达率在传代培养12～48 h最高为50%，这与Celis等［9］报告的未经同步化处理的羊膜细胞的PCNA表达阳性率为42%相似.因此可以推测，即使是有效的抑制，反义核酸作用后的蛋白表达率也不会高于这一数值，近30%的下调可以认为是有效的抑制了PCNA的表达.

　　实验结果还表明，反义PCNA可抑制RPE生长，在6.25 μmol．L-1浓度，作用3 d即可抑制细胞的增生，这种抑制作用随反义片段的浓度加大而增强，呈剂量依赖性.细胞周期也发生变化，S期DNA含量下降，G1期增加.细胞周期的改变与Jaskulski等［8］的报告一致. 他用18 mer的反义PCNA抑制经同步化处理的、鼠3T3细胞的生长，抑制率达47％；S期DNA含量降低，表明PCNA反义寡核苷酸的阻断作用发生在G1/S交界区或S早期.我们的结果显示，反义PCNA对RPE增生的最大抑制率为38.8%.反义核酸对细胞生长的抑制率与细胞是否同步化及生长活性等有关，对同步化细胞和肿瘤细胞的抑制率通常会较高些［8］. rPE为非同步化细胞，PCNA蛋白表达率最高为50%左右，细胞周期分析显示RPE的S期DNA含量为28.3％. rPE不是肿瘤细胞，只是可以恢复生长活性的一种非终末细胞,在实验条件下用单一血清培养时，RPE的增殖速率和DNA合成水平较低，因此反义核酸对其的抑制是有限的.但在临床作为手术后或防治PVR的一种辅助方法，有进一步研究的价值.

　　本实验没有显示反义核酸片段对RPE的bcl-2表达和细胞生长有明显作用,也未观察到对RPE的凋亡诱导作用. 我们推测，bcl-2在培养的RPE处于低水平表达［5］等因素与此有关.

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470742)

　　作者简介：王琳(1965-)，女(汉族)，山东省蓬莱县人.博士，讲师，主治医师. 发表论文20篇. Tel.(029)3373480王琳（第四军医大学　西京医院眼科）　惠延年（第四军医大学　西京医院眼科)

　　王雨生（第四军医大学　西京医院眼科)

　　惠宏襄（基础部生物化学教研室，陕西 西安 710033)

　　金明（基础部生物化学教研室，陕西 西安 710033）

　　参考文献:

　　［1］ Hui YN, liang HC, Cai YS et al. Corticosteroid and daunomycin in the prevention of experimental proliferative vitreoretinopathy induced by macrophages［J］. graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol, 1993;231(2):109-114.

　　［2］ 惠延年,梁厚成,胡　丹et al.玻璃体手术与地塞米松眼内灌注治疗增殖性玻璃体视网膜病变［J］.第四军医大学学报,1996;17(5):387-388.

　　［3］ Campochiaro PA. Pathogenic mechanisms in proliferative vitreoretinopathy［J］. arch Ophthalmol,1997;115(2):237-241.

　　［4］ Benett MR. The use of antisense oligonucleotides as therapeutic agents: a eview［J］. J Drug Dev Clin Pract,1995;7(3): 225-235.

　　［5］ 王　琳, 惠延年, 王雨生et al. PCNA与bcl-2在培养的人视网膜色素上皮细胞的表达［J］.中华眼底病杂志, 1998;14(1):26-28.

　　［6］ Lu QL, Poulsom R, Wong L et al. Bcl-2 expression in adult and embryonic non-haematopoietic tissues［J］. J Pathol, 1993;169(4):431-437.

　　［7］ 王　琳, 惠延年, 王雨生 et al.人视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏培养［J］.中华眼底病杂志,1997; 13(3): 157-159.

　　［8］ Jaskulski D, DeRiel JK, Mercer WE et al. Inhibition of cellular proliferation by antisense oligodeoxynuleotides to PCNA cyclin［J］. Science,1988;240(4858): 1544-1545.

　　［9］ Celis JE, Celis A. Cell cycle-dependent variations in distribution of the nuclear protein cyclin proliferating cell nuclear antigen in cultured cells: subdivision of S phase［J］. Proc Natl Acad Sci,1985;82(10): 3262-3266.

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