微波诱导视网膜神经细胞凋亡及硒的保护作用

　　第四军医大学学报2000年第21卷第6期

　　刘学东　龚书明　杨瑞华　陈景元　邓中荣　刘秀红

　　摘　要: 目的　观察微波诱导视网膜神经细胞凋亡及硒的保护作用.方法　体外培养视网膜神经细胞，按微波辐照强度分为4组辐照1 h. 选30 mW·cm-2组为防护组，在培养液中加入Na2SeO3后辐照. 照后测培养液温度、细胞存活率，激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡并进行荧光强度的定量分析.结果　培养液温度、细胞凋亡数量及荧光强度随微波辐照强度增大而增加. 加Na2SeO3后辐照可使凋亡细胞数量减少，荧光强度减弱.结论　微波可诱导视网膜神经细胞凋亡，Na2SeO3对此有保护作用.

　　关键词：微波；硒；视网膜；细胞凋亡；激光共聚焦显微镜

　　0　引言

　　近年来，随着微波技术在各个领域的广泛应用，微波的生物学效应越来越引起人们关注. 眼睛是微波作用的重要靶器官，但微波对眼损伤的研究多集中于晶体，而对视网膜损伤的报道较少［1］. 我们采用激光共聚焦显微镜观察了2450 MHz微波诱发体外培养视网膜神经细胞的凋亡作用，并观察了Na2SeO3对细胞凋亡的保护作用，为探讨微波对视网膜的损伤及防护提供一定的依据.

　　1　材料和方法

　　1.1　　细胞培养　猪眼球取自屠宰场，宰杀后立即摘取眼球，剪除周围多余的组织，清水充分洗涤，200 u的庆大霉素浸泡20 min，移入超净台，用Takahashi法［2］培养视网膜神经细胞.

　　1.2　辐照条件与实验分组　辐射源为上海微波医疗仪器厂生产的微波理疗机，频率2450 MHz，连续波 ，微波屏蔽室内辐照. 气温23℃～25℃，相对湿度30%～40%. 按微波强度分为对照组、10 mW·cm-2组、30 mW·cm-2组和60 mW·cm-2组，辐照时间为1 h，选30 mW·cm-2组作为防护实验组，在培养液中加入1 mmol·L-1的Na2SeO3. 培养瓶中均加入等量培养液.

　　1.3　指标测定　①7151型半导体温度计测定培养液温度.　②显微镜下观察细胞形态的改变. ③台盼蓝染色检测细胞存活率. ④激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡: 微波辐照后，收集细胞，PBS漂洗2～3次，生理盐水调整细胞密度为1×107 mL-1的细胞悬液，将细胞涂于预先涂有多聚赖氨酸的载玻片上，吹干，用新配制的40 g·L-1多聚甲醛室温下固定30 min，宝灵曼公司生产的细胞凋亡原位检测试剂盒进行检测，Bio-Rad MRC-1024激光共聚焦显微镜观察，每张玻片选取3个视野进行荧光强度的定量分析，结果以灰度值表示.

　　2　　结果

　　2.1　细胞培养　12～24 h后，部分细胞贴壁，细胞呈圆形或椭圆形，体积较小，核圆且相对透明，细胞分散存在，部分细胞伸出轴突.

　　2.2　微波辐照后培养液温度的变化　对照组培养液温度为(23.8±0.4)℃，10 mW·cm-2组为(24.1±0.3)℃，30 mW·cm-2组为(29.3±0.4)℃，60 mW·cm-2组为(33.6±0.3)℃，除10 mW·cm-2组与对照组间无显著性差异外，其余各组与对照组间均有显著性差异. 加硒组温度为(28.8±0.4)℃，与30 mW·cm-2组相比无显著性差异.

　　2.3　细胞形态观察　10 mW·cm-2组细胞部分聚集成团，边缘较模糊，30 mW·cm-2组成团细胞较多，部分细胞脱壁，细胞碎片增多，60 mW·cm-2组正常细胞明显减少，可见大量呈碎片状细胞.

　　2.4　细胞存活率　对照组细胞存活率为（99.8±1.3）%，10 mW·cm-2组为（99.2±0.9）%，与对照组相比无显著性差异，30 mW·cm-2组与60 mW·cm-2组分别为（88.9±3.4）%和（65.6±2.9）%，细胞存活率明显降低（P＜0.05）. 加硒组细胞存活率为（92.8±4.1）%，与30 mW·cm-2组相比无显著性差异（P＞0.05). 染料排斥阴性说明这些细胞仍为存活细胞或程序性死亡细胞.

　　2.5　激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡　微波辐照10 mW·cm-2 组细胞，加TUNEL反应液后，激光共聚焦显微镜下可见黄绿色荧光，染色质密度增高，并凝聚于核膜周围，即为凋亡的视网膜神经细胞（Fig 1），但凋亡细胞数量很少. 随着微波辐照强度的增加，凋亡细胞明显增加（Fig 2, 3）. 加硒后进行微波辐照，可见凋亡细胞数量明显减少（Fig 4）. 荧光强度分析可见，10 mW·cm-2 组荧光强度在 20～40 之间， 30 mW·cm-2 组荧光强度在70～75之间，60 mW·cm-2组荧光强度在70～110范围内波动，荧光强度随着微波辐照强度的增大而增加. 加硒组荧光强度为20～40之间，明显低于未加硒组.

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