（二）CYP1B1基因突变泊研究

　　随着研究的不断深入，人们对CYP1B1基因突变与PCG之间关系的认识也不断加深，以下，以Stoilov等[60]对PCG家系CYP1B1基因突变的研究为例，简要介绍对CYP1B1突变的研究方法。

　　1、CYP1B1基因突变的筛查方法

　　选择PCG家族，取家族成员血液标本，常规方法提取DNA。用3对引物在基因组DNA中扩增CYP1B1的转录区：引物1（1F，5’-TCTCCAGAGTCAGCTCCG-3’；1R，5’-GGGTCGTCGTGGCTGTAG-3’[786bp]）；引物2（2F，5’-ATGGCTTTCGGCCACTACT-3’；2R，5’-GATCTTGGTTTTGAGGGGTG-3’[787bp]）;引物3（3F，5’-TCCCAGAAATAT-CACACCTCACCTG-3’[885bp]）。PCR反应在40μl反应液中进行，其中，每对引物需1.0μl20μM保存液（stock solution），100μl基因组DNA，1Utaq多聚酶，dNTP各0.1mM,50mM氯化钾和10mM tris-氯化氢，共35个循环，每个循环包括变性94℃30秒，退火56℃30秒，延伸72℃1分钟。引物1和2需加1.5mM的氯化镁。反应结束后，用ABF-337自动DNA测序仪进行测序，限制性核酸内切酶可选用CfoI,TaqI,XboI和AciI等。

　　2、CYP1B1基因突变的研究

　　Stoilov等[62]在5个GLC3A相关家族中发现了一些可遗传的细胞色素P4501B1（CYP1B1）的突变。在一个近亲样和一个非近亲样家族中，有一长13个碱基的纯合性基因缺失，该缺失位于CYP1B1基因核苷酸链1410-1422处（外显子3内），引起阅读框的改变，使终止密码（TAG）提前出现，导致突变下游203个碱基缺失，产生一C末端缺少189个氨基酸的多肽链。与此相类似，另两个近亲家族核苷酸序列1209-1214（外显子2中）6个连续的胞嘧啶中，有一单碱基纯合性胞嘧啶插入，使该插入点后106个碱基处出现终止密码，产生一共缺失254个氨基酸的截短蛋白。第三个纯合性突变发现在一近亲家族中，其2号内含子和3号外显子间有一大的缺失，由于2号内含子3’端拼接区缺区，影响了CYP1B1基因的正常拼接，导致截短蛋白或无效等位基因的产生。

　　最近，Stoilov等[60]又对22个PCG家族的CYP1B1进行了序列分析，发现了16种突变。其中8种突变改变了的开放阅读框架，包括一个无义突变（Glu282→终止密码），6个移码突变（847insT,1209insC,1410dell3,1546dup10,1691delG,1749dup27）和一个大片段缺失。另有8种错义突变：Trp57变为Cys,Gly61变为Glu,Gly365变为TrP,Pro379变为Leu,Glu387变为Lys,Arg390变为His,Pro437变为Leu,Arg469变为Trp。在调查的家族中，CYP1B1等位基因符合常染色体隐性遗传规律。本次研究中，所有截短突变都截短了CYP1B1的开放阅读框，使CYP1B1多肽羧基端丢失了79-327个氨基酸。如果这样的蛋白合成，突变的分子会缺少血红素结合区，而该区对细胞色素P450分子的功能是否能正常执行关系重大，所以，此突变可能会造成功能性无效等位基因的产生。对各错义突变的分析：

　　（1）Try57→Cys:该突变位于hinge区，在CYP1B1蛋白中该区的顺序是51PPGPFAWP58。色氨酸存在于所于CYP1B1分子中，该残基是一个疏水性残基，有可能由于Try57→Cys使非极性疏水性色氨酸残基被半胱氨酸代替后，改变了CYP1B1分子正确的折叠方式。看来，hinge区对细胞色素P450分子行使正常功能十分关键。

　　（2）Gly61→Glu:此突变也位于hinge区内，脯氨酸残基下游3个氨基酸处。该残基是本区最保守的残基之一，Glu61很可能是hinge区的功能性成分。

　　（3）Gly365→Try和Pro379→Leu：这两个突变分别影响了螺旋J和螺旋K高度保守的末端和起始部。甘氨酸和脯氨酸都是螺旋结构N端和C端潜在的转角和螺旋结束区的重要组成部分，这两个突变影响了螺旋J和K的定位，而此二螺旋都是CCS区的组成部分。

　　（4）Arg390→His和Glu387→Lys：这两个残基均位于保守的螺旋K中，它们组成了GluXXArg序列，该序列在细胞色素P450超家族所有成员中是最保守的。Arg390和Glu387是螺旋转角的一部分，很可能组成了盐桥。可以推测该保守性motif对P450分子正常的功能非常重要，但尚不清楚其功能具体是什么。

　　（5）Pro437→Leu：该突变位于meander区，紧挨着血红素结合区。该突变影响xPcxFxPE+a序列（x代表任一氨基酸残基，a代表芳香族氨基酸残基，c代表带电荷的氨基酸残基，+代表带正电荷的氨基酸残基）的第一个脯氨酸残基。

　　（6）Arg467→Trp:Cys470在血红素结合区内，提供了血红素配体轴，由P450超家族中的绝对保守结构。Arg467→Trp影响了这个恒定的Cys470，可能由于突变产生的相对较大、活动不良的色氨酸妨碍了半胱氨酸行使正常的功能。

　　看来，许多突变均影响了CYP1B1分子的血红素结合能力，突变造成了血红素结合区的缺失、hinge区和/或CCS区成分的改变，而这些区域决定着细胞色素P450分子的准确折叠和血红素结合区的功能。到目前为止，尚未发现占优势的突变。但是，由于这些突变大部分均位于外显子3的5’端，这为在人群中筛查基因携带者提供了热点区域。

　　三、其它与青光眼有关的基因座

　　1996年，一个研究小组通过两点连锁和单元传递数据等方法把成年型原发性开角型青光眼的第一个基因座（GLCIB）定位于2cen-q13区域[67]。在受累个体中，4个关键性的交换把GLC1B基因座限定在D2S2161和D2S176之间长约11.2cm的区域内。与GLC1B相关的青光眼患者比GLC1A相关家族的表现型相对要轻一些。在这些家族中平均的发病确诊年龄为53岁。这些家族的患病个体中，33%的患者眼压低于22mmHg，67%的患者眼压值在22～40mmHg之间。这表明定位在染色体2q的GLC1B的基因座与中等眼压的COAG家族有关。

　　Writz等（1997）[68]在对一个美国家族的研究中，把第2个成年开明COAG的基因座（GLC1C）定位于3q21-24区。GLC1C基因座位于两个DNA标记物D3S3637和D3S1744之间长约11.1cm的区域内。最近，又进一步把GLC1C局限在D3S2637和D3S1550之间9.6cm的区域。本次研究中的患者表现出普通型青光眼的特点。发病年龄在35岁之后，高眼压，杯盘比增大，视野缺损等。10例患者中有3例（30%）进行了外科手术以降低眼压。

　　Akarsu等[69]对8例与GLC3A基因座无关的PCG（原发性先天性青光眼）家族进行了基因定位，发现其致病基因与一些位于1p36区的DNA标记物连锁。CLC3B基因座被定位在3cm的范围内，两侧分别为两组紧密连锁的标记物（D1S1597/D1S489/D1S228）和（D1S1176/D1S507/D1S407），当然，GLC3B的关键性区域要小于3cm[70]。

　　最近，又有两个与POAG有关的基因座被确定下来，COAG的第3个基因座GLC1D定位于染色体8q23区[71]，另1个新发现的座GLC1E定位于染色体10p15-p14区[72]。

　　四、总结

　　近两年来，对不同类型青光眼的位置作图和克隆化研究有了巨大的飞跃，为进一步研究青光眼的分子生物学和发病机制奠定了基础。在7例已知的青光眼基因座中，前两个基因座的突变已分别在1993年（GLC1E）和1995年（GLC3A）完成了作图，另外5个基因座突变的作图也即将完成。

　　对POAG家族TIGR的基因突变的研究，把青光眼的眼组织细胞和分子药理学的研究者和对该基因进行直接位置作图和克隆化以逆推其功能的研究者联系在一起。该基因已从分化的TM培养细胞（TIGR）中单独克隆出来，并在睫状体（CBS-670）和视网膜（MYOC）的cMDA文库中确定了它所处的位置。其编码的蛋白控制房水经小梁网的外流。通过对JOAG家族TIGR编码序列的筛查，发现所有突变均位于3号外显子内，提示该区可能是突变的热点。

　　1997年，在一些原发性先天性青光眼（PCG）的患者中发现了细胞色素P4501B1（CYP1B1）基因的突变。这些突变在来自不同地理区域的散发性和家族性病例可都有发现。位于染色体2p21的GLC3A基因座目前看来是先天性青光眼最主要的突变位点。各方面的基因连锁数据表明在一些青光眼较高发的种族，如土耳其人，沙特阿拉伯人和斯洛伐克的吉普赛人的许多家系中，GLC3A均定位于2p21染色体的相同部位。初步统计显示85%-90%的青光眼病例都是由CYP1B1突变引起。显而易见，这对于该疾病的诊断和预后有重要的意义。通过对正常双亲散发病例的突变研究，提示PCG的遗传方式（甚至在散发的个体中）是常染色体隐性遗传。细胞色素P450家族中的蛋白有许多是代谢通路中（如甾类化合物的产生和花生四烯酸的代谢）的催化剂，有理由推测CYP1B1参与了分子的代谢，这对于前房角的正常发育和功能形成至关重要。尽管现在认为CYP1B1可催化17β-雌二醇的4-醇羟化反应，但其更详尽的底物还尚未完全知晓。值得注意的是两种不同类型青光眼的发病都与类固醇的代谢有关，其中CYP1B1参与类固醇中间产物的合成，而类固醇可诱导TIGR的表达。有没有可能CYP1B1作用于一种类固醇分子，而这种分子又可影响TIGR蛋白的表达呢？值得人们进一步研究和探讨。

上一页  [1] [2] [3] [4] 下一页