糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养和超微结构研究

　　中华眼科杂志2000年第36卷第3期

　　葛坚　林明楷　卓业鸿　郑健梁

　　摘　要　目的　探索糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养方法及超微结构的特点。方法　从小梁切除术中取得的巩膜内板层，应用组织学培养方法进行患者小梁细胞体外培养及鉴定，并将糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞与正常小梁细胞的超微结构进行分析和比较。结果　糖皮质激素性青光眼患者小梁组织培养的细胞经鉴定确为小梁细胞，但与正常小梁细胞相比，其细胞的微绒毛、吞饮小泡及胞浆的溶酶体含量较少。结论　糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养成功使小梁细胞培养体系更加完善，糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞超微结构的改变可能是青光眼发病的细胞基础。

　　关键词：糖皮质激素类；青光眼；小梁网；细胞，培养的；显微镜检查，电子

　　小梁细胞体外培养研究现已成为青光眼发病机制研究中最热门的课题，许多类型的青光眼如原发开角型青光眼、糖皮质激素性青光眼等均表现出一定的细胞学基础。如果能从青光眼患者房水流出通道获得小梁细胞，则可提供一独特的机会来研究青光眼发病的细胞机制和可能的治疗方法。几年来，我们在小梁细胞体外培养成功的基础上，进行糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养和超微结构研究，现将结果报告如下。

　　材料和方法

　　一、材料

　　1．组织块：来源于中山眼科中心青光眼专业确诊并行小梁切除术的糖皮质激素性青光眼患者，从小梁切除术中取得的带小梁的巩膜内板层组织块。糖皮质激素性青光眼的诊断标准：明确用糖皮质激素滴眼液病史，连续用药至少3个月，用量为0.1%地塞米松滴眼液10支,每支10 ml；房角开放，色素较多；特征性的晶状体后囊下混浊;外周血淋巴细胞糖皮质激素受体结合位点较高［1］；有典型的青光眼视功能损害，并与用药史及基础眼压一致；病情进展较快。

　　2．已鉴定的正常小梁细胞。

　　3．主要试剂：DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物研究所），电镜固定液，电镜染液，免疫组化试剂盒（华美生物工程公司），兔抗人纤维连接蛋白单克隆抗体(anti-fibronectin，Anti-FN),兔抗人层粘连蛋白单克隆抗体(anti-laminin， anti-LN)，兔抗人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体(anti-neuron specific enolase， Anti-NSE)(美国Dako公司)。

　　4．主要仪器设备：CO2培养箱（美国Forma公司），培养瓶，倒置相差显微镜，超薄切片机，透射电镜。

　　二、方法

　　1．细胞培养：将从小梁切除术中取得的带小梁的巩膜内板层组织块放入取材液中，在移入培养瓶之前，确认组织块内皮面并将小梁面贴壁，当贴壁确切后，加入DMEM培养基，其中含20%胎牛血清、1×105 iU/L青霉素及100 ng/L链霉素。置于37℃、体积分数为0.05的CO2、体积分数为0.95的空气及一定湿度的培养箱中培养。每5～7天换液1次,约2周时细胞长出，细胞局部融合后，用0.25%胰蛋白酶消化后传代。

　　2．小梁细胞鉴定：用鉴定正常小梁细胞的方法［2］，取第3代融合细胞，通过形态学（光镜、电镜），免疫组织化学方法（Anti-LN、Anti-FN、Anti-NSE染色）予以鉴定。做免疫组化前，将融合生长的小梁细胞用胰酶消化，滴于培养瓶中的盖玻片上，置于培养箱中培养3天，染色前用PBS或Hanks液充分洗涤，纯冷丙酮固定10～20 min，制成细胞铺片。

　　3．超微结构研究：分别收集糖皮质激素性青光眼患者和正常的体外培养的第4代小梁细胞，离心、固定，切片，染色，透射电镜观察，并将两组细胞的超微结构进行比较分析。

　　结果

　　一、小梁细胞生长过程

　　糖皮质激素性青光眼患者的小梁细胞自巩膜组织块中长出约需2周，原代细胞生长缓慢，约2～3周方达到局部融合。小梁细胞的形态呈三角形、星形、不规则形，细胞体积大，多突起；细胞核呈圆形、椭圆形，位于细胞的中央，核仁明显。原代细胞形态略不一致，传2或 3代后细胞形态渐一致，细胞融合时呈旋涡状，细胞体紧密相接，但无重叠生长（图1）。

　　二、小梁细胞鉴定

　　电镜下培养的糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞表面有绒毛突起，细胞间有缝隙连接和紧密连接，细胞器多，细胞核质分布不均，核仁明显且有多个。免疫组织化学染色（Anti-LN、Anti-FN、Anti-NSE染色）均为阳性（图2）。

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