作者：倪同上，刘相和，迟焕芳 作者单位：青岛大学医学院人体解剖学教研室, 山东 青岛 266021
【摘要】 目的 观察枸杞子提取液（LBA）对RCS大鼠视网膜色素变性的治疗作用。方法 RCS大鼠24只，随机分为给药组和对照组，各12只。给药组大鼠出生后10 d开始喂食LBA(1 mg/kg), 对照组大鼠喂食等量生理盐水。两组大鼠分别于生后25、35、45 d处死，取出眼球，制备组织切片，苏木精-伊红染色和TUNEL法检测视网膜感光细胞的数量。结果 与对照组比较，给药组大鼠出生25 d时感光细胞数目增多，TUNEL阳性细胞数目减少，差异有统计学意义(t=3.12、3.41,P<0.05)。结论 在RCS大鼠视网膜变性的早期应用LBA，可对早期变性的神经元发挥保护作用。
【关键词】 视网膜；枸杞子；大鼠
THE PROTECTION OF LBA ON THE HEREDITARY RETINAL DYSTROPHY RCS RATS NI TONG-SHANG, LIU XIANG-HE, CHI HUAN-FANG (Department of Anatomy, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021,China)
［ABSTRACT］ Objective To observe the therapeutic effect of LBA on the hereditary retinal dystrophy RCS rats. MethodsA total of 24 RCS rats were evenly divided into treatment and control group in random. Starting from 10 postnatal days, LBA1 mg/kg was fed on in the treatment group and saline on the control. Photoreceptor necrosis and apoptosis were assessed by HE staining and TUNEL detection. Results Compared with the control, at 25 postnatal days, the number of photoreceptor was more than that of the control (t=3.12,P<0.05), the number of TUNEL positive cells decreased (t=3.41,P<0.05). Conclusion Early use of LBA is of protective action on early stage of retinal degeneration.
［KEY WORDS］ Retina; Fructus Lycii; Rats
视网膜色素变性是眼科十分常见的一种致盲性疾病，目前全世界约有数百万病人，在我国其发病率呈逐年上升趋势。RCS大鼠是一种自发性蜕变的大鼠，视网膜色素上皮不能有效吞噬感光细胞外节脱落的膜盘，致使膜盘堆积，感光细胞变性［1，2］，为研究视网膜色素变性的经典动物模型。 LAVAIL等［3,4］研究显示，RCS大鼠视网膜色素变性过程中感光细胞处于低氧状态，高浓度氧可延缓感光细胞的凋亡，而氧不足则加速感光细胞的凋亡。枸杞子是茄科植物宁夏枸杞(Lycium barbarum L．)的成熟干燥果实，为常用中药，具有滋补肝肾、益精明目之功效［5］。有研究结果显示，枸杞子对青光眼的节细胞（RGCs）有神经保护作用［5］。然而，以往研究结果缺乏广泛的动物病理模型实验结果支持。本实验观察枸杞子提取液（LBA，香港大学惠赠）对RCS大鼠视网膜色素变性神经元的保护作用，为视网膜色素变性疾病的治疗提供实验和理论依据。
1 材料和方法
1.1 动物及分组
雄性RCS胎鼠24只，体质量50~60 g，随机分为给药组和对照组,各12只。12 h光照、12 h黑暗循环条件下饲养，自由饮食、饮水。给药组大鼠出生后10 d开始喂食LBA（1 mg/kg）,对照组大鼠喂食等量生理盐水。
1.2 标本制作
两组大鼠分别在生后25、35、45 d，用水合氯醛（400 mg/kg）腹腔麻醉后，取出眼球，冲洗后立即放入40 g/L多聚甲醛溶液中固定6 h，去眼前节及玻璃体，依次放入100 g/L蔗糖溶液中2 h， 200 g/L蔗糖溶液2 h， 300 g/L蔗糖溶液中过夜。用OCT包埋剂填满眼球,沿眼球矢状面作连续冷冻切片，每个标本各取5张切片，厚度5 μm。
1.3 原位细胞凋亡检测
采用苏木精-伊红及TUNEL染色法。切片常规脱蜡、脱水后,0.01 mol/L PBS冲洗。Proteinase K(20 mg/L,10 mmol/L Tris/HCl, pH 7.4)37 ℃孵育30 min, 0.01 mol/L PBS冲洗2 min,冲洗3次。蒸馏水新鲜配制体积分数0.03 H2O2室温浸泡10 min，0.01 mol/L PBS冲洗2 min，冲洗3次。
新鲜配制体积分数0.001 Triton X-100 枸橼酸钠缓冲液，4 ℃浸泡5 min，0.01 mol/L PBS冲洗2 min，冲洗3次。滴加TUNEL 混合反应液，于37 ℃下，60 min,0.01 mol/L PBS冲洗2 min，冲洗3次。在激光显微镜下观察，激发波长为450~500 nm，观察波长为515~565 nm。
1.4 结果观察
苏木精-伊红染色：光学显微镜下，每张切片取4个视野，200倍视野下计数 30 μm 长的外核层感光细胞的数目。TUNEL检测：TUNEL阳性表达细胞胞核呈绿色荧光，观察视网膜每100 μm长的视野内阳性细胞数。
1.5 统计学处理
结果用x±s表示，采用SPSS 10.0软件进行数据处理，两样本均数比较采用t检验。
2 结 果
2.1 苏木精-伊红染色
对照组RCS大鼠出生15 d时，视网膜未发育成熟；25 d时，感光细胞染色加深，其数目有所减少，外节形态不规则，内节明显变窄；35 d时感光细胞数目与25 d相比明显减少(t=4.56,P<0.05)；45 d时，感光细胞数目与35 d相比明显减少，视网膜色素上皮细胞排列紊乱，体积增大，外形不规则，内核层细胞、神经节细胞形态和数目基本正常。给药组大鼠出生25 d时，感光细胞数目较对照组细胞多（t=3.12，P<0.05）；35 d时，感光细胞数目较其25 d时下降（t=3.52,P<0.05）；45 d时感光细胞数目与对照组比较无明显差异（P>0.05）。见表1。
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