作者：司艳芳，韩泉洪，惠延年，马吉献，张冠宝
关键词: 玻璃体视网膜病，增生性;肌动蛋白类;免疫组织化学
摘 要:目的 观察PVR增生膜中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达. 方法 用免疫组化染色法和免疫荧光法对14例视网膜脱离伴PVR行玻切术时切除的增生膜（PRM）进行检查、分析. 结果 免疫组化染色法显示α-SMA在14例PRM中均有表达，位于胞质中，其分布与PRM的收缩方向一致.在200倍视野下，PRM C级膜中α-SMA阳性细胞比例为35/80，D级膜中α-SMA阳性细胞比例为50/60;免疫荧光法结果与染色法相符.荧光定量分析:PRM C级膜中α-SMA阳性荧光总量12.31.D级膜中α-SMA阳性荧光总量23.09，约为C级膜的1.88倍（P<0.01）. 结论 α-SMA存在于PVR增生膜中，与病变程度和膜的收缩过程有关.
Expression ofα┐smooth muscle actin in periretinal membrane of proliferative vitreoretinopathy
SI Yan-Fang，HAN Quan-Hong，HUI Yan-Ni-an，MA Ji-Xian，ZHANG Guan-Bao
Department of Ophthalmology，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China，2 Xuchang Health and Epidemic Prevention Station，Xuchang，461000
Keywords:vitreoretinopathy proliferative;actins;immuno-histochemistry
Abstract:AIM To investigate the expression of alpha-smooth muscle actin（α-SMA）within the periretinal mem-brane（PRM）of PVR.METHODS Fourteen specimens of PRM were obtained during vitrectomies of patients suffered from PVR of different grades.α-SMA expression in PRM were detected by immunohistochemical staining，and quanti-tative analysis performed by image process of immunofluo┐rescence.RESULTS α-SMA expression was detected in all14PRMs.The distributions ofα-SMA were present in the cytoplasma，and accordance with the direction of stress fibers..α-SMA expression was stronger in PVR/D than in PVR/C.CONCLUSION Expression ofα-SMA was a com-mon feature of PRM，and the expression correlated with severity of PVR and the process of membrane traction.
0 引言
增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo-retinopathy，PVR）属于眼内组织创伤愈合的一种特殊表现，可以分为炎症期、细胞增生期和瘢痕期三个阶段，其中在细胞增生期可以形成视网膜表面的增生膜组织（PRM），这些膜组织在瘢痕期可以明显收缩，形成对视网膜的牵拉而导致视网膜脱离［1，2］ .视网膜色素上皮细胞（RPE）是参与增生膜形成的主要细胞之一，在PVR病变过程中可以有明显的形态改变，部分RPE可以转化为肌纤维母细胞样细胞而具有收缩功能［3］ .α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）是一种有收缩功能的细胞骨架微丝结构
［4］ .McGillem［5］ 等曾报道:在PVR病变的增生膜中有多种细胞表达α-SMA，但针对α-SMA在增生膜中的整体表达及其与PVR病变程度的相关性研究，尚未见报道.本实验采用免疫组化技术，观察PVR的视网膜前膜中α-SMA的表达情况.
1 材料和方法
1.1 材料
标本来源于1998-07/1999-11在本院眼科住院的孔源性视网膜脱离伴PVR患者14名，年龄4～63岁，病程2mo～2a.PVR分级标准参照1983年美国视网膜学会分级方法，分级为C3-D3.以上患眼行玻璃体切割术时取视网膜表面增生膜，其中下膜5例，前膜9例.以上组织用40g・L-1 多聚甲醛固定30min，4℃.经脱水、透明和浸蜡，制成腊块，然后制成5μm厚的切片，贴附于载玻片上.小鼠抗人的α-SMA单克隆抗体（1∶200;中国博士德公司），DAB免疫组化试剂盒（DAKO公司，丹麦），Avidin标记的Texas Red（Molecular Probes，美国）. 1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色及免疫荧光
切片浸入7.5mL・L-1 H2 O2 -PBS，37℃，30min，以阻断内源性过氧化物酶.正常羊血清封闭消除非特异性染色.滴加小鼠特异性抗体，在湿盒内37℃保温30min.PBS振洗3次，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，在湿盒内37℃保温30min，免疫组织化学染色法滴加ABC复合剂，37℃保温30min.加入显色剂显色，镜下观察，水洗中止反应，苏木精复染核，脱水透明封片.免疫荧光法加入抗生物素化标记的Texas Red，37℃保温30min.缓冲甘油封片.采用人大隐静脉血管组织作为阳性对照;采用人类角膜移植后供体眼的眼后段组织，包括视网膜色素上皮细胞（RPE）、视网膜组织、脉络膜和巩膜，以及不加一抗的标本作为阴性对照，与手术取材标本平行染色.
1.2.2 结果判定和分析
免疫组织化学DAB染色法的结果:在OLMPUS显微镜（BX50）下观察，以背景清晰、棕黄色部位定位明确的细胞作为阳性细胞，在200倍视野下，计数阳性细胞比例.
Texas Red荧光标本在BIO-RED共聚焦显微镜（MR-1024）下观察，作定量分析:任意选一视野，在相同面积下计数荧光总量.
2 结果
阳性对照组显示均对所用的单克隆抗体呈阳性反应:DAB染色阳性细胞胞质中呈现棕色或深棕色的颗粒，细胞核经复染成蓝色;Texas Red在595nm激光激发下，阳性部位发出深红色颗粒样荧光.阴性对照组中未见阳性染色及荧光.
DAB染色结果显示，在14例PRM中α-SMA均有阳性表达，但其表达的程度有所差别.在6例PVR/C3级的PRM中，可见细胞成份较多，细胞间质较少，α-SMA表达阳性细胞的比例为35/80，呈散在分布，随分布区域的不同细胞染色以及形状表现有差异:在膜的表面可见少量染色较深，胞体呈梭形，胞核呈圆形或卵圆形的阳性细胞;在细胞较多的区域，阳性细胞数目较多，染色较浅淡，胞体为长圆形，胞核呈圆形，在部分阳性细胞中可见色素存在（Fig1（略））;在膜的中央组织中可见少量阳性细胞，胞体呈狭长的梭形，与标本的长径走行方向平行;在8例D级PRM中，α-SMA阳性细胞比例约为50/60，多分布在膜的表面，染色深，细胞呈梭形，胞核为长圆形（Fig2（略）），常可见此类细胞在膜组织的起伏处呈“搭桥样”存在，在组织的中央区域阳性细胞较少.
免疫荧光与DAB染色结果相一致.在C级膜中，阳性部位多位于膜的周边，量较少（Fig3（略））;在D级膜中，阳性部位多位于膜的表面，量较多（Fig4（略））.
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