作者：周金子 作者单位：（410008）中国湖南省长沙市，中南大学湘雅医院眼科
【摘要】目的：研究血管内皮生长因子小干扰RNA(VEGF small interfering RNA,VEGF siRNA)对兔眼碱烧伤后角膜新生血管的抑制作用。
方法：普通家兔25只以碱烧伤法（1mol/L NaOH溶液）诱导角膜新生血管（CNV）生成。碱烧伤后立即以脂质体（LF2000）为载体，右眼球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒，左眼球结膜下注射pSilencer 2.1U6 hygro空白质粒作为阴性对照。碱烧伤后1，3，5，7，14d，形态学分析评价角膜新生血管的生长情况。
结果：与对照眼相比，碱烧伤后球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒，实验眼在各时间段（3,5,7,14d），CNV长度明显变短，面积明显变小，差异有统计学意义（P＜0.05）。
结论：VEGF siRNA能有效地抑制碱烧伤后CNV的形成。
【关键词】 RNA干扰 角膜 新生血管 兔
0引言
角膜新生血管（CNV）形成是许多角膜疾病如角膜化学性烧伤、角膜炎或溃疡等共有的病理过程，常导致角膜透明性下降及明显的视力障碍。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是病理性新生血管形成的主要调控因子，目前通过调控VEGF的表达来抑制新生血管生长已成为研究的一大热点［1］。RNA干扰因能引起特异性同源性靶基因沉默［2］而成为主要的方法之一。我们采用VEGF特异性的小干扰RNA（VEGF siRNA）研究其对碱烧伤兔角膜VEGF mRNA的抑制作用，探讨其对角膜新生血管治疗的可行性。
1材料和方法
1.1材料 DL2000 DNA Marker（TaKaRa,日本）；脂质体LipofectamineTM（LF2000，美国Invitrogen公司）；VEGF干扰RNA表达质粒由GATAGAGCAAGACAAGAAA 序列插入pSilencer2.1U6 hygro 的BamHI和HindIII酶切位点构成（由美国Texas大学MD Anderson癌症研究中心Dr Zhou ZC惠赠）；空载体pSilencer2.1U6 hygro（Dr Zhou ZC惠赠）。普通家兔由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。
1.2方法 取普通家兔25只，雌雄兼用，体质量2.0～2.5kg, 用裂隙灯显微镜检查兔眼角膜正常。先制备角膜碱烧伤动物模型。然后25只兔随机分为5组，每组5只，构成碱烧伤后1，3，5，7，14d组。30g/L戊巴比妥钠（30mg/kg）兔耳缘静脉注射麻醉,5g/L丁卡因滴眼液点眼2次表麻后,棉签吸除结膜囊液体,将统一规格直径10mmWhatmanⅢ滤纸片浸泡于1mol/L NaOH溶液中1min,达饱和状态,棉签吸去多余的NaOH液，然后置于兔子双眼角膜中央1min,取下滤纸,用生理盐水冲洗角膜及结膜囊2min, 制备角膜碱烧伤动物模型。按以上步骤制备角膜碱烧伤动物模型后随即每只兔右眼四个象限球结膜下各注射VEGF siRNA（500mg/L）与Lipofectamine（LF2000）混合液10μL（体积1∶1，混匀，注射前室温下静置30min）,共计40μL，左眼四个象限球结膜下各注射pSilencer2.1U6 hygro（500mg/L）与Lipofectamine（LF2000）混合液10μL（体积1∶1，混匀，注射前室温下静置30min）,共计40μL，以后双眼隔天注射1次。术后3d每日滴抗生素眼药水及眼膏预防感染。兔眼球结膜下注药24h后，每日用裂隙灯显微镜观察双眼新生血管发生的情况,至出现CNV后，改为隔日观察，每次均测量自角膜缘长出的CNV长度并记录、照相。测量时，以连续弯曲度小、CNV朝向角膜混浊中心生长的最长血管为准，并计算CNV生长面积A，A=C/12×3.1416［r2（rl）2］,其中C为CNV累及角膜的圆周钟点数,l为CNV从角膜缘伸入角膜的长度, r为角膜半径。
统计学处理：各组数据均以表示，两组间均数的比较采用配对t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
双侧CNV兔模型左眼球结膜下注射pSilencer2.1U6 hygro空白质粒（对照组），右眼球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒（实验组）后各组CNV变化如下：肉眼下术后1d ，双眼碱烧伤斑明显，可见角膜上皮损伤，角膜水肿，角巩膜缘血管轻度扩张充血；术后3d,左眼可见局部角巩膜缘处有新生血管芽向角膜中心生长,角巩膜缘血管扩张充血较前明显，右眼角巩膜缘除血管扩张充血外，几乎看不见新生血管芽萌出；术后5d,左眼角巩膜缘处新生血管已明显变长，顶端已出现分叉，右眼角膜缘四周也有新生血管向中心生长，但较左眼为短。术后7d,左眼新生血管迅速增长，其顶端分叉更加明显，部分交织成网状，局部血管已侵入碱烧伤斑，右眼情况类似，但较左眼明显为短。术后14d,左眼角膜新生血管呈垂柳状从四周长入碱烧伤斑，占据大部分角膜，但新生血管变得细而稀疏。右眼新生血管较左眼明显要短,要稀疏，尤其质粒注射部位几乎没有血管生长（图1）。以前述方法测量双眼CNV长度并计算其生长面积, 角膜碱烧伤后3，5，7，14d，实验组CNV长度及其生长面积明显小于对照组（P﹤0.05，表1）。
表1 兔碱烧伤后角膜新生血管长度和面积比较（略）
aP＜0.05vs对照组
图1 碱烧伤后角膜新生血管的形态学观察（略）
[1] [2] 下一页 |
