吕瀛娟   杨洁   颜华

天津医科大学眼科中心   天津医科大学免疫教研室   天津医科大学总医院   300070

目的：应用SYBR Green I荧光定量PCR 方法检测外伤性视神经损伤后Caspase 3 基因mRNA表达变化。

方法：应用液压颅脑损伤仪建立大鼠外伤性视神经损伤动物模型，伤后1、3、5、7、9、14、28天处死，以Trizol法提取新鲜视网膜组织总RNA，以Oligo(dt)18 为引物逆转录合成cDNA 并进行扩增，以T/A 克隆法将纯化的目的片断与T/A克隆载体（pTZ57R/T）连接成重组质粒并转化E.coli DH5α。采用碱裂解法提取重组质粒，经蓝白筛选、酶切、测序鉴定后，根据标准品建立标准曲线，由软件自动计算出待测样本中靶基因mRNA准确含量，并以靶基因和内参GAPDH mRNA 含量的比值作为评价靶基因表达水平的指标。

结果：①由pTZ57R/T与目的基因所构建的标准曲线线性关系良好、灵敏度高、特异性强、准确可靠。②视神经损伤后5天Caspase 3mRNA表达明显增加，9天时达到高峰，14天后开始下降。与对照组表达水平相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

结论：促凋亡基因Caspase 3在视神经损伤后视网膜神经节细胞的凋亡发生发展过程中起重要作用。