作者：闫果林, 吴有盛, 郭群, 安晶, 刘新平*, 张作明* 作者单位：第四军医大学: 1航空航天医学系航空航天临床医学教研室 航空航天医学教育部重点实验室, 2基础部生物化学与分子生物学教研室, 陕西 西安 710032
【摘要】目的: 分段克隆昆明种小鼠磷酸二酯酶(PDE) β亚单位编码基因pde6b CDS序列全长, 分析比较昆明种小鼠与C57BL/6J小鼠PDE β亚单位编码基因pde6b序列的差异。方法: 设计覆盖pde6b CDS区的引物序列, 通过逆转录聚合酶链式反应扩增并克隆入载体pMD18T中, 转化大肠杆菌,酶切鉴定后测序。通过生物信息检索、 序列拼接并应用生物信息学相关软件进行序列分析。结果: 克隆了野生型昆明种小鼠的pde6b CDS全长。昆明种小鼠与C57BL/6J小鼠pde6b CDS区(NM_008806)相比较存在如下不同: 昆明种小鼠第706位碱基为A, 而数据库中序列NM_008806为G; 第1149位碱基前者为T, 后者为C。昆明种小鼠与C57BL/6J小鼠pde6b编码的蛋白序列差异并不明显, 仅有第236位氨基酸残基为甘氨酸（G）突变成丝氨酸（S）, 为相对保守性替换关系。结论: 克隆了昆明种小鼠pde6b CDS 区全长序列; pde6b基因在不同种属小鼠之间编码序列存在差异, 表现出多样性特点, 但蛋白序列保守性较高。
【关键词】 视网膜色素变性 磷酸二酯酶 pde6b 多态性
Analysis of pde6b mRNA sequences of Kunming mice and C57BL/6J mice
YAN Guolin, WU Yousheng, GUO Qun, AN Jing, LIU Xinping*, ZHANG Zuoming*
Department of Clinical Aerospace Medicine Aerospace Medicine, Key Laboratory of Ministry of Education, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China
[Abstract] AIM: To clone and sequence the phosphodiesterase 6 β subunit (pde6b) gene of Kunming mice, and to compare it with counterpart sequences in the GenBank database. METHODS: The primers were designed covering the CDS region of the pde6b gene, and the corresponding fragments were amplified using RTPCR. The fragments were cloned into plasmids, amplified in E.coli, and sequenced. Bioinformatics programs and online tools were used to analyze the sequences. RESULTS: The CDS of the pde6b gene of Kunming mice was cloned and sequenced. Compared with the inbred mice C57BL/6J, pde6b CDS sequence of Kunming mice was different in some points: a G→A transition at +706, a C→T transversion at +1149. The protein sequence was of little difference: only a glycine→serine at +236. CONCLUSION: The pde6b CDS region of Kunming mice was successfully cloned. Pde6b sequences are of some level difference in different kinds of mice, but they are most conserved in protein level.
[Keywords]retinitis pigmentosa; phosphodiesterase; pde6b; polymorphorism
磷酸二酯酶（phosphodiesterase, PDE）在光传导过程中发挥着重要作用, 外界光子的刺激使视紫红质（rhodopsin）活化, 后者激活光转导素（transducin）, 活化的转导素又激活了视杆细胞中的PDE, PDE降解感光细胞内环磷酸鸟苷（cGMP）使其浓度降低。cGMP 是光感受器离子通道的特异性受体, 它的降解导致视杆细胞膜阳离子通道关闭, Na+、 Ca2+内流减少, 光感细胞超极化, 从而引起视觉冲动向视觉中枢逐级传递, 人们因此而感受到光线的刺激[1, 2]。现在已经发现, PDE的异常在很多视网膜色素变性疾病患者中广泛存在[3, 4]。视杆细胞PDE由α、 β和2个γ亚基组成, 其中α、 β为活性亚基, 与抑制性亚基分离后可以单独或者协同发挥生理功能。pde6b基因编码由856个氨基酸残基组成的PDE β亚单位, 它的突变常常引起PDE功能异常, 光传导链被切断, 并最终导致光感受器细胞的凋亡[5]。视网膜退行性变（retinal degeneration, rd1）小鼠是被人们广泛研究的一种视网膜色素变性小鼠模型, 致病基因被确定为pde6b[6], 其exon7上一个无义突变是导致疾病发生的原因[7]。在实验中发现一种视网膜退行性变小鼠（昆明种来源）, 遂将其与野生型昆明种小鼠交配而建立了家系。目前已经确定其遗传方式为常染色体隐性遗传, 其视网膜病变表现出发病早、 进展快的特点[8], 与文献报道的rd1小鼠很相似, 推测其可能也与pde6b基因的异常有关。由于公共数据库中缺乏昆明种小鼠的序列信息, 为了分析视网膜色素变性小鼠的pde6b基因的异常, 设计引物扩增pde6b CDS并测序。
1 材料和方法
1.1 材料 野生型昆明种小鼠（16只, 8周左右, 体质量20～25 g, 雌雄各半）购自第四军医大学动物实验中心; TRIzol试剂、 dATP为Invitrogen公司产品; rTaq DNA聚合酶（TaqTM）、 dNTPs、 Pyrobest DNA聚合酶、 EcoRⅠ、 HindⅢ内切酶、 T4 DNA连接酶、 pMD18T 载体购自TaKaRa公司, AMV逆转录酶、 Oligo(dT)15 引物为Promega公司产品; 凝胶回收试剂盒、质粒微量提取试剂盒为Ugene公司产品。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据NCBI核酸数据库中NM_008806.1序列设计扩增pde6b CDS序列的引物pde6b_Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ、 Ⅳ、 Ⅴ、 Ⅵ和pde6b_Ⅶ(表1), 参照文献[9]应用序列特异性引物聚合酶链反应（polymerase chain reacionsequence specific primer, SSPPCR）方法扩增昆明小鼠pde6b基因相应片段。
表1 扩增pde6b CDS序列的引物pde6b_Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ、 Ⅳ、 Ⅴ、 Ⅵ和pde6b_Ⅶ的引物序列（略）
Tab 1 Primers for amplifying fragments of the pde6b gene
1.2.2 视网膜总RNA的提取 颈脱臼法处死16只昆明种小鼠, 无菌剪刀取眼球, 1×PBS漂洗, 显微镜下剪去眼前节, 将眼后节放入液氮速冻。
1.2.3 RTPCR 取眼后节组织约50 μg(单只小鼠双眼球, 16组)用TRIzol试剂提取视网膜总RNA, 适量DEPC水溶解。2 μg total RNA分别以Oligo（dT）15 Primer和基因特异性引物pde6b_Ⅶ asp为引物用AMV RT反转录酶反转录cDNA。Oligo（dT） 15 Primer反转录体系为: 2.0 μg总RNA, Oligo（dT）15 Primer 1.0 μg, 10 mmol/L4×dNTPs 2.5 μL, 总体积10 μL; Gene Specific Primer pde6b_Ⅶ asp反转录体系为: 2.0 μg总RNA, 10 μmol/L pde6b_Ⅶ asp 3.5 μL, 10 mmol/L4×dNTPs 2.5 μL, 总体积10 μL。70℃变性10 min, 立即置冰上5 min, 加入AMV RT后置热循环仪上42℃反应60 min。PCR反应体系为10×PCR buffer 2.5 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL, 10 μmol/L Sp/Asp 1.0 μL, cDNA模板1.0 μL, 5 U/μL Pyrobest DNApol 1.0 μL, ddH2O 17 μL。循环参数设置如下: 预变性95℃, 5 min, 变性95℃, 30 s, 退火53～54℃, 40 s, 延伸72℃, 40 s, 40个循环, 72℃, 7 min。pde6b_Ⅰ、 pde6b_Ⅲ、 pde6b_Ⅵ退火温度为53℃, pde6b_Ⅱ、 pde6b_Ⅳ退火温度为54℃, pde6b_Ⅴ、 pde6b_Ⅶ 采用Touchdown PCR方法扩增, 循环条件为: 预变性95℃, 5 min, 变性95℃, 30 s, 退火66℃0.5℃30 S 55℃, 延伸72℃, 40 s, 40个循环, 72℃, 7 min。
1.2.4 克隆载体的构建及序列测定 扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳分离, 紫外灯下切取目标片段, 用Ugene H.Q.＆Q.凝胶回收试剂盒Ⅱ进行胶回收。采用如下体系进行加A反应: 40 μL胶回收产物, 10×PCR buffer 5 μL, 2.5 mmol/L dATPs 5 μL, 5 U/μL rTaq 1.0 μL。反应完成后胶回收目的片段, 以10 μL体系连接, 16℃过夜。取过夜连接产物按照常规方法转化感受态细胞XL10。37℃孵箱中培养16 h后可见明显菌落生成, 挑取单克隆菌落37℃以200 r/min震荡培养过夜。无菌超净台中收取细菌, Ugene H.Q.＆Q.质粒微量提取试剂盒提取质粒, EcoRⅠ、 HindⅢ内切酶双酶切鉴定。将每个片段鉴定正确的至少3个克隆送公司测序。
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