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1.2.5 序列分析 对于每只小鼠RTPCR扩增的各片段测序结果, 首先在NCBI上利用VecSreen程序查找并去除测序报告中的载体序列, 然后通过BLASTTn检索相关序列, 再将测序得到相同片段的采用CLUSTAL W (1.83)程序进行多序列比对, 对于不一致的个别碱基以2条序列相同者为正确, 提取出一条准确的序列; 然后将2条邻接序列进行序列比对, 去除重复序列后拼接出pde6b CDS序列全长。对拼接出的16只昆明种野生小鼠pde6b CDS序列全长与核酸数据库序列进行序列比对, 查找碱基突变位点。
2 结果
2.1 pde6b各片段基因扩增 用Pyrobest高保真酶在53℃和54℃退火条件下扩增可分别得到pde6b_ⅠⅢⅥ和pde6b_ⅡⅣ片段, 用Touch Down PCR方法扩增得到了pde6b_Ⅴ和pde6b_Ⅶ片段, 各片段产物电泳结果如图（图1）。
图1 pde6b各片段扩增产物（略）
Fig 1 Electrophoresis of amplified pde6b fragments
M: DNA marker; 1-7: pde6b_Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ、 Ⅳ、 Ⅴ、 Ⅵ、 Ⅶ.
2.2 序列分析 在NCBI上进行Vector Screen检索, 除去vector 序列, 进一步通过数据库BLASTn寻找高度相似序列, 然后相邻序列两两之间BLAST将重合序列去除, 从而拼接出昆明小鼠pde6b基因CDS全长。昆明小鼠pde6b基因CDS全长, 与数据库中小鼠pde6b mRNA序列比对后发现存在如下序列多样性: 昆明种小鼠第706位碱基为A, 而数据库中序列NM_008806为G(图2A), 相应密码子分别为AGC和GGC, 分别编码丝氨酸（Ser, S）和甘氨酸（Gly, G）; 第1149碱基前者为T, 后者为C(图2B), 相应密码子为GTT和GTC, 同为编码缬氨酸(Val, V)的密码子。将核酸序列转换为蛋白序列之后进行序列比对发现昆明种小鼠的第236位氨基酸残基为甘氨酸（G）突变成丝氨酸（S）, 二者均是中性氨基酸, 为相对保守性替换关系; 二者同为野生型小鼠PDEβ亚单位的蛋白序列, 说明这种序列上的不一致并不影响蛋白质的功能结构域的形成, 不会造成疾病表型的出现。
图2 序列测定显示昆明小鼠与C57BL/6J小鼠pde6b开放读框的差异（略）
Fig 2 The difference of pde6b ORF between Kunming and C57BL/6J mice
A: G→A transition at ORF +706; B: C→T transversion at ORF +1149.
3 讨论
pde6b基因编码视杆细胞PDE β亚单位, 后者是PDE的催化亚基, 发挥降解cGMP的作用, 而cGMP是视杆细胞外节盘膜上离子通道的特异性配体[10]。暗环境下, cGMP结合离子通道使其处于开放状态, Na+、 Ca2+内流, K+外流, 细胞处于静息状态。当外界光线增强时, 光子激活视杆细胞的光敏蛋白—视紫红质（rhodopsin）, 后者通过光致构象变化而活化, PDE的活性亚基α和β降解cGMP, 使杆体细胞膜上阳离子通道关闭, Na+、 Ca2+内流减少, 细胞超极化, 把光学信号转化为电信号, 再经过电信号的转导、 编码和放大形成视觉信息向视觉中枢传递, 从而感知光线和图形变化[1, 2]。研究发现PDE活性的丧失、 cGMP积聚和光感受器的凋亡同时存在[11]。PDE蛋白的4个亚单位αβγγ的异常都可能引起功能失调, 特别是α和β亚单位的失活会使PDE失去催化活性, 最终引起视杆细胞凋亡[12]。生物信息学分析, PDEβ亚单位二级结构由2个GAF结构域和一个PDEase_Ⅰ结构域组成, GAF结构域在光敏色素和cGMP PDE中特异性存在, PDEase_Ⅰ结构域是催化活性中心, 这2种结构域上的异常可以引起常染色体隐性遗传的视网膜色素变性。
昆明种小鼠是一种封闭群动物, 野生型昆明种小鼠的pde6b序列仍不清楚; 通过小鼠兄妹交配的方法建立起基于昆明种背景的视网膜色素变性近交系小鼠, 实验中发现的视网膜退行性变小鼠的核酸序列是否存在突变要以野生型昆明种小鼠相应核酸序列为基础。因此对野生型昆明种小鼠pde6b基因CDS区进行了序列测定, 发现其与公共数据库中的序列存在差异, 呈现多样性的特点。昆明种小鼠第706位碱基为A, 而数据库中序列NM_008806为G; 第1149碱基前者为T, 后者为C。蛋白序列上差异不明显, 仅有第236位氨基酸残基为甘氨酸（G）突变成丝氨酸（S）, 前者为疏水性氨基酸, 而后者为极性氨基酸, 为相对保守性替换关系。二者同为野生型小鼠PDEβ亚单位的蛋白序列, 说明这种序列上的不一致并不影响蛋白质的功能结构域的形成, 不会造成疾病表型的出现。
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