作者：赵丽娟 丁正平    作者单位：257000 山东省东营市胜利油田中心医院　430000 湖北省武汉市华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科

　　【摘要】目的 观察L－选择素在碱烧伤角膜组织中表达情况，探讨角膜碱烧伤病理损伤机制。方法 将46只SD大鼠随机分成碱烧伤组和正常组。通过免疫组化和西印迹法（Western blot）观察碱烧伤不同阶段L－选择素的表达情况。结果 免疫组化显示，碱烧伤后8h、1d表达不明显（P>0.05）， 2d～7d，其表达有明显地统计学意义，并于第7天达到高峰（P<0.05）,随后开始下降。Weston blot显示与免疫组化相似地变化趋势。结论 L-选择素参与碱烧伤后角膜组织病理损伤过程。

　　【关键词】  L－选择素 角膜碱烧伤 大鼠 免疫组化 西印迹法

　　Expression of L-selectin in cornea after alkali burns 
    
　　Zhao lijuan, Ding zhengping
    
　　The victory oil-field center hospital ophthalmology of camp City in the province east of Shandong, 257000
    
　　Abstract   Objective   Observe the expression of L-selectin in the pathological process of alkali burns in order to probe into the pathological damage mechanism of cornea alkali burns. Methods      46 SD rats were compared between the burned and non-burned groups. Immunohistochemistry and Western blot were respectedly performed to observe the expression of L-selectin. Results    By immunohistochemistry we can find at 8h and 1 day after alkali burns, it expressed very few (P>0.05). During the period from the second day to the 7th day, it expressed more and more obvious and peak in the 7th day (P<0.05). Then began to decline. And Weston blotting also shows the same outcome. Conclusion      L-selectin participates in the tissue's damage process after alkali burns.
    
　　Key words     L-selectin; Cornea alkali-burns; Rat; Immunohistochemistry; Western blot
           
　　在角膜的化学烧伤中，碱性烧伤是最严重的。碱性化学物质有皂化作用，它极易深入深部组织，因此对眼部的危害是持续的。碱烧伤后常发生顽固性溃疡，甚至溶解穿孔，在这个病理过程中，有许多免疫因子参与其中。近年来对于作为血管粘附分子大家族中成员之一的选择素家族在角膜碱烧伤中的作用也越来越得到更多的重视。

　　1  试剂与仪器

　　1.1  试剂   L-selectin抗体（博士德生物工程有限公司）、SP试剂盒（北京中山生物技术有限公司）、Western blot试剂盒（Sigma）。

　　1.2  仪器  QUANTIMET-900图像分析系统（购自英国剑桥公司）、HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统。

　　1.3  实验方法  46只成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，随机分为2组：①42只烧伤后右眼角膜作为实验组；②另42只烧伤后左眼角膜作为自身对照组。将碱烧伤后8h、第1、2、3、4、7d、2w分别随机抽取6只大鼠，采用注射麻药法处死动物，取其双眼角膜，以观察L-选择素的表达情况。

　　1.4  结果处理  免疫组化染色及Western blot检测角膜组织中L-选择素的表达

　　1.5  统计学分析  实验数据用均数±标准差（x±s）表示，运用SPSS 11.5统计学软件进行两均数之间的t检验，P<0.05有意义。

　　2  结果
    
　　从表1可看出，在碱烧伤后8h、第1d 大鼠角膜组织中L-选择素的表达与其自身对照组没有明显的统计学差异（P>0.05），2d～2w，大鼠角膜组织中L-选择素的表达增加，并且与自身对照组相比，差异具有显著性意义（P<0.05）。

　　表1  碱烧伤大鼠免疫组化检测不同时期角膜L-选择素的平均光密度值（略）

　　其中，*代表P<0.05,▲代表P>0.05，从表2可看出，在碱烧伤后，于各个观察点(8h、4d、7d、2w)均可见其表达。
    
　　表2  碱烧伤大鼠Western blot检测不同时期角膜L-选择素光密度值（OD值）（略）

　　3  讨论
     
　　L-选择素（L-selectin）又称为LEAM-1、淋巴细胞归巢受体，隶属于黏附分子中的选择素家族，是近几年研究比较热门的一种物质。其表达于淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、部分NK细胞、未成熟的造血细胞及嗜酸性细胞等多种细胞上［1］。已有实验证明，L-选择素在感染、休克、缺血－再灌注损伤、肿瘤等疾病中，均起着不可忽视的作用［2-5］。在眼科，对L-选择素在炎症反应以及某些与免疫反应相关的眼科疾病中的作用已经取得明显进展［6-7］，但是对于其在角膜碱烧伤中的表达特点，目前国内外尚无相关报道。本研究通过人为碱烧伤SD大鼠角膜，制成角膜碱烧伤模型，运用免疫组化及Western blot两种方法进行检测，实验结果表明， L-选择素可能参与角膜碱烧伤后组织病理损伤过程，并且在碱烧伤后早期（8h～1d）表达并不显著，这可能与这一时间段内炎症反应不显著有关，随着时间的推移其表达是在持续增加的，但是仅限于短时期内，并不一直持续于整个碱烧伤过程中。本实验仅对L-选择素进行初步测定，对于是否在应用某些对其有抑制作用的药物（例如SKK-60060、ARP［8-9］）可以减轻其表达，进而影响碱烧伤后组织损伤程度以及控制L-选择素表达后，对于碱烧伤其它致病因素有何影响等问题，还有待于研究。

　　【参考文献】

　　［1］ Jutila MA, Watts G, Walcheck B, et al. Characterization of a functionally important and evolutionarily well-conserved epitope mapped to the short consenrus repeats of E-selectin and L-selectin. J Exp Med, 1992, 175: 1565-1573

　　［2］ Kansas GS. Selectins and there ligands：current concepts and controversies ［J］. Blood, 1996, 88(9):3259-3287

　　［3］ Tamatani T, Kuida K, Watanabe T, et al. Molecular mechamisms underlying lymphocyte recirculution Ⅲ Characterization of the LECAM-1(L-selectin)-dependent adhesion pathway in rats. J Immunol, 1997, 159:952-963

　　［4］ Simon SI, Cherapanov V, Nadra I, et al. Signaling functions of L-selectin in neutrophils atterations in the cytoskeleton and colocalization with CD18 ［J］. J Immunol, 1999,163(5): 2891-2901

　　［5］ Arbones ML, Ord DC, Ley K, et al. Lymphocyte homing and leukocyte rolling and migration are impaired in L-selectin-deficent mice. Immunity, 1:247

　　［6］ Arbones ML, Ord DC, Ley K, et al. Lymphocyte homing and leukocyte rolling and migration are impaired in L-selectin-deficent mice. Immunity, 1:247

　　［7］ Seo SK, Park HY, Choi JH, et al. Blocking 4-1BB/4-1BB ligand interactions prevents herpetic stromal keratitis. J immunol, 2003, 171:576-583

　　［8］ Yamashiro K, Kiryu J, Tsujikawa A, et al. Suppressive effects of selectin inhibitor SKK-60060 on the leukocyte infiltration during endotoxin induced uveitis. Br J Ophthal, 2003, 87: 476-480

　　［9］ Miyamoto K, Ogura YC, Hamada M, et al. In vivo neutralization of P-selectin inhibits leukocyte-endothelial interactions in retinal microcirculation during ocular inflammation. Microvascular Research, 1998, 55(3): 230-240