作者：徐为海，袁志兰 作者单位：(210029)中国江苏省南京市，南京医科大学第一临床医学院眼科教研室
【摘要】 目的：探讨金雀异黄素(genistein，Gen)对兔角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)的抑制作用。方法：取新西兰大白兔13只,不造模1只观察药物对眼表前房等组织的不良反应。其余12只24眼采用浸润1mol/L NaOH滤纸片贴敷角膜中心60s，诱导碱烧伤CNV形成,左眼用二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液，右眼用Gen的DMSO溶液点眼。碱烧伤后3，7，14，21d测量角膜CNV面积,处死相应组别的动物取眼球做切片HE染色和免疫组织化学染色观察角膜和前房等情况。结果：兔角膜碱烧伤后CNV存在生长和消退的病理变化,Gen+DMSO组角膜CNV面积与DMSO组相比有明显的统计学差异性(P<0.01)。结论：Gen对于兔角膜碱烧伤模型的CNV有明显的抑制作用。
【关键词】 角膜新生血管;碱烧伤;金雀异黄素;兔
Inhibition of experimental alkaliinduced corneal neovascularization in rabbits by using genistein
WeiHai Xu, ZhiLan Yuan
Department of Ophthalmology, the First Clinical College of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Abstract
AIM: To evaluate the effect of genistein (Gen) administration on corneal Alkaliinduced corneal neovascularization (CNV) in rabbits.
METHODS:One of 13 normal New Zealand white rabbits was used to observe the drug adverse reactions in the anterior chamber and other organizations. The remaining 12 rabbits (24 eyes) were used of 1mol/L NaOH infiltration applicated of filter paper on the center cornea for 60 seconds, induced by alkali burn in the formation of CNV, then were randomly divided into 4 groups as 3, 7, 14 days and 21 days. Immediately after alkali burn on eyes, rabbits were administered by dimethyl sulfoxide (DMSO) solution on the left eyes (control) and Gen soluted by DMSO on the right eyes. Digital photographs of the cornea were taken and analyzed to determine the area of the cornea covered by CNV on the day of 3, 7, 14 days and 21days after alkali burn. In addition,HE staining and immunohistochemical analysis was used to determine vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in corneal tissue after the rabbits were excuted.
RESULTS: Analysis of digital photographs showed that there was less CNV Gentreated eyes than in controls (P<0.01, compired t test). In addition, there was less staining for VEGF in corneas from Gentreated eyes than in control eyes. Gen solution drops were not associated with any complications during observation.
CONCLUSION: Genistein administration decreased alkali burn corneal neovascularization in rabbits.
KEYWORDS: corneal neovascularization; alkali burn; genistein; rabbit
0引言
角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)与感染、外伤、角膜移植以及配戴角膜接触镜等因素有关。在病理情况下，毛细血管由角膜缘向角膜中央生长，形成CNV，继而出血、渗出、继发纤维化改变可致角膜丧失透明性，引起视力下降甚至失明，是目前全球范围内主要的致盲眼病之一。在发达国家，CNV引起的眼部疾病已占失明原因的首位[1]，也是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素。因此，如何有效地防治CNV的形成和生长，一直以来都是眼科学界的一个热点和难点。金雀异黄素 (genistein,Gen)即5 , 7 , 4 三羟基异黄酮，也称染料木素，主要存在于豆科植物中。有研究表明其在防癌[2]、治疗心血管疾病及防止骨质疏松等方面有积极作用[3,4]。在对眼科疾病研究主要集中于眼底新生血管的防治中，且表明Gen对于CNV有明确的抑制作用[5]。我们比较兔角膜碱烧伤后使用Gen配制成的滴眼液与空白对照治疗的不同变化，分析Gen对碱烧伤CNV生成以及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)在碱烧伤角膜中的表达情况，以揭示Gen，VEGF以及CNV间的关系，并为临床治疗CNV提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料 健康纯种清洁级新西兰大白兔13只，由江苏省实验动物中心提供，体质量1.8～2.2kg，2～3月龄，雌 图1 Gen+DMSO点眼碱烧伤角膜病变雄不限，实验前进行双眼外眼、角膜、虹膜、前房、瞳孔及晶状体检查，同时进行角膜的直径测量，平均直径为14mm左右，排除明显大角膜或小角膜，及其他异常，各组角膜大小无明显统计学差异。随机取1只不进行造模，双眼分别点滴DMSO及Gen的DMSO溶液，以观察药物对眼表、前房等组织的不良反应。余以30g/L戊巴比妥钠以30mg/kg自兔耳缘静脉iv麻醉，开睑器开睑，盐酸倍诺喜眼液点眼3次，棉签吸干结膜囊内液体，将浸在1mol/L氢氧化钠(NaOH)的直径为10mm的滤纸片，吸除多余NaOH溶液后置于兔角膜中央60s;生理盐水冲洗角膜及结膜囊3min。角膜碱烧伤模型以角膜浅层水肿，混浊明显，呈毛玻璃状，角膜实质较深层亦损伤，虹膜隐见为造模成功的标准。其余12只24眼均成功进行造模，均以左眼使用DMSO作对照组，右眼使用Gen的DMSO溶液治疗组，均以3次/d点眼。Gen购于Sigma公司，溶于稀释的300g/L DMSO水溶液(购于Gibco公司)，配制成5mg/L的溶液。
1.2方法 术后2d内在裂隙灯显微镜下进行反复观察，直至CNV形成后，改为1次/d进行观察，连续21d。记录CNV的生长情况，计算造模后3，7，14，21d的CNV面积。按公式 S=C/12×3.1416[r2(rl)2](C为新生血管累及角膜的圆周钟点数，l为CNV从角膜缘深入角膜最长血管的长度， r为兔角膜半径)计算CNV生长面积(S)并照相。于3，7，14，21d以空气栓塞法各处死相应组别的实验动物，摘除眼球，剪下带有少量巩膜组织的角膜，以100g/L甲醛溶液固定标本，后常规行石蜡包埋，选择从CNV密集的部位角膜缘至角膜中心连线做垂直于角膜表面的连续切片厚度4μm，进行HE和免疫组化染色，显微镜下观察并照相。具体方法：石腊包埋切片，3mL/L过氧化氢孵育30min，PBS浸泡，加入100mL/L正常山羊血清(PBS稀释)10min，加入鼠抗兔VEGF mAb(1∶30)一抗，PBS冲洗，滴加广谱生物素标记的山羊抗小鼠IgG抗体37℃孵育，ABC显色剂显色，复染，封片。所有试剂均由北京中山试表1 造模角膜不同组别CNV面积剂公司提供。HE染色用于光学显微镜下观察角膜的病理改变。免疫组化染色后阳性细胞呈棕黄色或黄色颗粒，VEGF含量的不同，显色会有深浅不同的变化。由淡黄色至棕黑色不等。
统计学分析：实验结果用±s表示，用SPSS 13.0统计软件分析。组间差异性比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1造模后裂隙灯观察 通过对未行碱烧伤造模组兔角膜使用Gen和DMSO后观察，其角膜均无明显炎症反应，证明无明显毒副反应。使用DMSO点滴碱烧伤兔角膜，2d后角膜缘开始出现新生血管向角膜中央长入，管腔较粗大，血管密集，直至第14d新生血管生长速度达峰值，以后CNV生长相对趋缓。Gen+DMSO治疗组整体较DMSO对照组新生血管生长相对延缓，范围明显缩小，且血管稀疏，管腔细小(图1)。
2.2 CNV面积 Gen+DMSO治疗组CNV面积和DMSO组比较差异有统计学意义(P<0.01，表1)。
2.3角膜组织学变化 正常兔角膜组织分为5层，胶原纤维呈板层排列整齐，无血管结构，可于未行角膜碱烧伤造模而只使用DMSO及Gen点眼的角膜中清晰观察到。DMSO组基质层结构紊乱，炎细胞浸润明显，可见大量新生血管，血管腔粗大，内可见红细胞，以碱烧伤后14d尤为明显。Gen+DMSO治疗组角膜基质少量炎性细胞浸润，有稀疏血管，管腔细小，介于DMSO组和未行碱烧伤造模角膜之间(图2)。图2 造模后14d角膜组织学(HE×100) A:DMSO;B：Gen+DMSO
图3 造模后14d角膜VEGF的表达(SABC×400) A:DMSO;B：Gen+DMSO
2.4 VEGF的表达 在未行碱烧伤造模角膜组织VEGF不表达或在上皮基底膜有微弱表达，而仅使用DMSO治疗组角膜全层VEGF表达明显增强，阳性反应为胞质内棕黄色或棕色颗粒，其表达部位主要分布在形成的新生血管区域(图3)细胞胞质内，提示VEGF在胞质内表达;Gen+DMSO治疗组较DMSO组明显减低，相应在角膜基质层形成新生血管区域的VEGF表达相对较少。
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