作者：杨成明 张兰华 赵燕颖 吴雅臻    作者单位：吉林大学第二医院眼科，吉林 长春 130021

　　【摘要】  目的 设计和构建整合素αvβ3(integrin αvβ3)特异性的小干扰RNA表达载体,并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法 设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamH I-Hind Ⅲ酶切线性化的pGCsilencer2.0-U6质粒上,转染重组质粒到人视网膜血管内皮细胞,通过免疫印迹 (Western印迹) 及逆转录（RT-PCR）实验检测靶基因的抑制情况。结果 成功构建pGCU6-ITGαv和pGCU6-ITGβ3 siRNAs重组质粒,转染人视网膜血管内皮细胞，Western印迹，RT-PCR 结果证实重组质粒在蛋白及mRNA水平均能抑制整合素αvβ3的表达。结论 成功构建了针对整合素αvβ3的siRNA质粒，该质粒可抑制整合素αvβ3 在人视网膜血管内皮细胞中的表达。

　　【关键词】  RNA干扰；人视网膜血管内皮细胞；整合素αvβ3；转染

　　视网膜新生血管可由多种眼病引起，如视网膜静脉阻塞，眼缺血综合症，增殖性糖尿病视网膜病变，早产儿视网膜病变等。抑制视网膜新生血管生长是治疗此类疾病的关键〔1～2〕。整合素(integrin)是一类细胞表面受体家族,由α和β两条链通过非共价键连接而成的异源二聚体跨膜糖蛋白〔3〕。这一类受体参与细胞与基质、细胞与细胞之间的黏附,在很多重要的生理过程中起重要作用。迄今为止发现23种整合素亚型，其中整合素αvβ3在正常的血管内皮细胞中表达很少，而在新生血管内皮细胞有高度表达，其中缺氧是其主要诱因之一〔4〕。αvβ3与配体结合后通过丝裂原激活的蛋白激酶途径使内皮细胞增殖，分化和迁移形成血管〔5～6〕。因此，整合素αvβ3逐渐被认为是新生血管组织的标记物。本研究拟通过RNA干涉技术建立针对整合素αvβ3的干涉质粒并观察其对人视网膜血管内皮细胞中整合素αvβ3的干涉效果，期望为人视网膜新生血管疾病的基因治疗提供实验基础。

　　1  材料与方法

　　1.1   材料  带有U6启动子及GFP的质粒pGCsilencer 2.0-U6购自上海吉凯化学公司，人视网膜新生血管细胞(HRCECs)及大肠杆菌JM109由本研究室保存，IMDM及小牛血清为Gibco产品，限制性内切酶 BamH I及Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶，Trizol及RT-PCR其他相关试剂购自Takara公司，梭华转染试剂为沈阳联星生物技术有限公司产品，整合素αvβ3 鼠抗人单克隆抗体、兔抗鼠GAPDH多克隆抗体为 Santa Cruz 产品。

　　1.2   方法

　　1.2.1   pGCsilencer 2.0-U6/ αvβ3  siRNA重组质粒的构建及鉴定  从GenBank中整合素αv和整合素β3 mRNA 序列上寻找符合特征的靶序列,合成分别针对其编码区碱基序列的两条DNA寡核苷酸链，每条正义链包括5′ 末端BamH I酶切位点和反向的两个一致的靶序列(19 bp)，两个靶序列之间被9 bp的非同源序列( TTCAAGAGA)所间隔。3 ′末端加有TTTTTT及Hind III 酶切位点。其中整合素αv-1：5′GATCCGGAGGATTC
AGCATTGATTCTCAAGAGAAATCAATGCTGAATCCTCCTTTTTTGGAAA-3′；整合素αv-2：5′-AGCTTTTCCAAAAAAGGAGGATTCAGCATTGATTTCTCTTGAGAATCAATGCTGAATCCTCCG-3′。整合素β3-1：5′-GATCCGATTGGCTGGAGGAATGATTTCAAGAGAATCATTCCTCCAGCCAATCTTTTTTGGAAA-3′；整合素β3-2：5′-AGCTTTTCCAAAAAAGATTGGCTGGAGGAATGATTCTCT
TGAAATCATTCCTCCAGCCAATCG-3′。
   
　　合成的两条互补寡核苷酸链在退火缓冲液(100 mmol/L 醋酸钾30 mmol/L HEPES-KOH，2 mmol/L醋酸镁，pH 7.4)作用下退火(90 ℃ 1 min，37 ℃ 18 h)，形成双链结构。将pGCsilencer 2.0-U6分别用BamH I和Hind Ⅲ限制性内切酶消化，在T4 DNA连接酶的作用下，将两者于160℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌感受态，Ampicillin抗性筛选出阳性菌落，摇菌扩增,抽提质粒，质粒进行BamH I和Hind Ⅲ酶切鉴定及测序比较。

　　1.2.2  细胞培养  HRCECs 细胞用IMDM培养基，10% PBS，37℃，5% CO2培养。观察细胞生长情况，每2～3天用胰酶消化进行传代培养。

　　1.2.3  人视网膜血管内皮细胞缺氧模型的建立及分组  选用第3～6代HRCECs进行实验。待细胞长满瓶底后，用橡皮塞密封培养瓶口，插入两个中枪头作为进气及排气孔，同时将输液用滴管通过进气孔向瓶内充入5%CO2和95%N2混合气体（0.5 kg/cm2）,持续30 min，使瓶内处于相对缺氧状态，再放入5%CO2孵箱中继续培养。实验共分5组：正常对照组，缺氧对照组，si-integrinαv组，si-integrinβ3组及空载体转染组。

　　1.2.4  重组质粒的转染  将模型建立后的缺氧对照组细胞再传1代。当贴壁细胞达到60%～80%融合，用无血清培养基洗3遍，具体转染方法详见梭华转染试剂盒说明，于转染后48 h收集细胞，分别用蛋白裂解液及Trizol试剂提取总蛋白及总RNA备用。

　　1.2.5  Western 印迹分析  取上述总蛋白50 μg作SDS-PAGE电泳。用电转仪将蛋白转移到PVDF膜上，封闭4℃过夜。次晨，TBST〔20 mm  Tris-HCl （PH 7.4），0.15 M NaCl，0.1%Tween〕洗3遍，5 min/遍，分别加入整合素αv和β3 鼠抗人多克隆抗体（1∶500）及GAPDH鼠抗人单克隆抗体（1∶500）室温孵育3 h，TBST洗3遍，5 min/遍，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠多克隆二抗〔1∶2 000〕1 h，TBST洗三遍，5 min/遍，TBS（20 mM  Tris-HCl（pH7.4），0.15 M NaCl）洗1遍，5 min，用显色液（碱性磷酸酶buffer 3 ml，NBT 12 μl，BCIP 9 μl）显色，晾干拍照。

　　1.2.6  RT-PCR检测整合素αvβ3 mRNA  取上述总RNA3 μg进行逆转录，PCR扩增整合素αvβ3和内参照GAPDH。整合素αv引物序列为：正义链5′-CCAAAGCAAACACCACCCAG-3′；反义链5′-TTGAAATCTCCGACAGCCAC-3′;扩增片断长度为574 bp。整合素β3引物序列为：正义链5′ -TGACAATCATTACTCTGCCTCC-3′；反义链5′-ACGCACTTCCAGCTCTACTTT3′；扩增片断长度为250 bp。反应条件：94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，30个循环后，72℃延伸10 min。

　　1.3  统计学处理  用SPSS10.0软件，t检验判断差异。

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